抗菌和抑菌效果評(píng)價(jià)方法

抗菌和抑菌效果評(píng)價(jià)方法抗菌和抑菌效果評(píng)價(jià)方法1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了抗菌和抑菌評(píng)價(jià)方法的選擇原則和使用。本標(biāo)準(zhǔn)適用于具有抗菌和(或)抑菌功能產(chǎn)品的抗菌、抑菌效果的鑒定。2標(biāo)準(zhǔn)性引用文件以下文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不行少的。但凡注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。但凡不注日期的引用文件，其最版本〔包括全部的修改單〕適用于本文件。GB15979一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)FZ/T73023抗菌針織品消毒技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)〔2023版〕衛(wèi)生部〔衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2023〕282號(hào)〕3以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1抗菌antibacterial承受化學(xué)或物理方法殺滅或阻礙細(xì)菌生長(zhǎng)生殖，可削減其數(shù)量以及活性的過(guò)程。3.2抑菌bacteriostasis承受化學(xué)或物理方法抑制或阻礙細(xì)菌生長(zhǎng)生殖及其活性的過(guò)程。3.3持續(xù)抗菌作用sustainedantibacterialaction具有抗菌作用的消毒產(chǎn)品涂于物體外表，持續(xù)7d以上仍具有殺滅或阻礙細(xì)菌生長(zhǎng)生殖作用。3.4中和劑neutralizer在殺滅微生物試驗(yàn)中，用以消退試驗(yàn)微生物與消毒劑的混懸液中，以及微生物外表上殘留的消毒劑，使其失去對(duì)微生物抑制和殺滅作用的試劑。評(píng)價(jià)方法的選擇原則抗菌試驗(yàn)與抑菌試驗(yàn)區(qū)分抗菌試驗(yàn)：測(cè)定抗菌產(chǎn)品對(duì)細(xì)菌和真菌的抗菌作用，試驗(yàn)過(guò)程中需要用中和劑終止殺菌作用。抑菌試驗(yàn)：測(cè)定抑菌產(chǎn)品對(duì)細(xì)菌和真菌的抑菌作用，試驗(yàn)過(guò)程中不需要使用中和劑終止抑菌作用。依據(jù)產(chǎn)品性能選擇適宜的評(píng)價(jià)方法抑菌效果評(píng)價(jià)方法的選擇原則抑菌類(lèi)產(chǎn)品選擇抑菌效果評(píng)價(jià)方法。液體抑菌產(chǎn)品選擇懸液定量抑菌試驗(yàn)，膏體或半固體凝膠類(lèi)、黏稠狀抑菌產(chǎn)品選擇載體浸泡定量抑菌試驗(yàn)，濕巾類(lèi)或其他自身含有抑菌成分的產(chǎn)品選擇載體抑菌試驗(yàn)，肥皂類(lèi)固體抑菌產(chǎn)品選擇抑菌環(huán)試驗(yàn)，含有可溶性抑菌成分的紡織品選擇浸漬抑菌試驗(yàn)，含有持續(xù)抑菌作用的抑菌洗液選擇滯留抑菌試驗(yàn)?？咕Чu(píng)價(jià)方法的選擇原則抗菌類(lèi)產(chǎn)品選擇抗菌效果評(píng)價(jià)方法。液體抗菌產(chǎn)品選擇懸液定量殺菌試驗(yàn)，凝膠狀或膏狀抗菌產(chǎn)品選擇載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)，濕巾類(lèi)或其他自身含有抗菌成分的產(chǎn)品選擇載體殺菌試驗(yàn)，含有可溶性抗菌成分的紡織品選擇浸漬抗菌試驗(yàn)。含有不行溶抗菌成分的紡織品、無(wú)紡布、纖維等，經(jīng)鑒別不含可溶性抗抑菌成分后，承受燒瓶振蕩試驗(yàn)。含有不行溶抗菌成分的瓷磚、塑料、金屬、涂料等，承受貼膜試驗(yàn)；對(duì)于涂于外表，枯燥后具有持續(xù)抗菌作用的產(chǎn)品，進(jìn)展持續(xù)抗菌試驗(yàn)。評(píng)價(jià)方法抑菌效果懸液定量抑菌試驗(yàn)適用范圍適用于液體抑菌制劑如衛(wèi)生洗液、抑菌噴霧劑等對(duì)微生物抑菌效果的測(cè)定。試劑、培育基及器材試驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌〔ATCC6538〕、大腸桿菌〔8099〕、白色念珠菌〔ATCC10231〕及依據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌株。試劑稀釋液：0.03mol/L磷酸鹽緩沖液〔PBS〕〔pH7.2～7.4〕，培育基：金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培育使用養(yǎng)分瓊脂培育基，白色念珠菌的培育使用沙氏瓊脂培育基。器材恒溫水浴箱、計(jì)時(shí)器、Ⅱ級(jí)生物安全柜等。試驗(yàn)步驟取試驗(yàn)菌24h穎斜面培育物用PBS洗下，用PBS稀釋至約5.0×105CFU/mL～4.5×106CFU/mL5.0mL樣品〔依據(jù)使用說(shuō)明書(shū)要求使用原液或稀釋液〕，置20℃±1℃水浴中5min后，再參與0.1mL試驗(yàn)用菌懸液，快速混勻并馬上計(jì)時(shí)。待試驗(yàn)菌與樣品相互作用至說(shuō)明書(shū)的規(guī)定時(shí)間，分別吸取1.0mL試驗(yàn)菌與樣品混合液接種2個(gè)平皿，傾注培育基。菌量無(wú)法計(jì)數(shù)時(shí)，以PBS做10倍系列稀釋?zhuān)x適宜稀釋度分別吸取1.0mL接種2個(gè)平皿，做活菌培育計(jì)數(shù)。PBS代替樣品，進(jìn)展平行試驗(yàn)，作為陽(yáng)性比照。陽(yáng)性比照回收菌落數(shù)在1.0×104CFU/mL～9.0×104CFU/mL之間。取同批次PBS、培育基作陰性比照。全部試驗(yàn)樣本和比照樣本均在36℃±1℃培育，細(xì)菌生殖體培育48h觀看最終結(jié)果；白色念珠菌培育72h觀看最終結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。抑菌率計(jì)算%100010?-=AAAX...................................(1)式中：X—抑菌率，%；A0—陽(yáng)性比照組回收菌量，單位為CFU/mL；A1—試驗(yàn)組回CFU/mL。5.1.1.5抑菌率≥50%～90%，判有抑菌作用；抑菌率≥90%，判有較強(qiáng)抑菌作用。5.1.25.1.2.1適用于膏體或半固體凝膠類(lèi)、黏稠狀抑菌產(chǎn)品對(duì)微生物抑菌效果5.1.2.2載體為10mm×10mm 脫脂白平紋布片，脫脂方法依照《消毒技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》〔2023版〕進(jìn)展，使用前壓力蒸汽滅菌備用，電子天平〔d=0.01g〕，5.1.1.2。5.1.2.3操作步驟取試驗(yàn)菌24h穎斜面培育物用PBS洗下，用PBS稀釋至約5.0×106CFU/mL～5.0×107CFU/mL制成菌懸液備用。用微量移液器滴染10μl菌懸液于滅菌載體上，36℃±1℃烘干或室溫晾干備用。按5g/20℃±1℃水浴5min，用無(wú)菌鑷子取染菌載體，使載體完全浸沒(méi)于樣品中，馬上計(jì)時(shí)。待染菌載體與樣品相互作用至說(shuō)明書(shū)的規(guī)定時(shí)間，分別取染菌載體參與5.0mLPBS1.0mL樣液，按活菌培育計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管樣液接種2個(gè)平皿。如平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)較多時(shí)，可用PBS進(jìn)展10倍系列稀釋后，再進(jìn)展活菌培育計(jì)數(shù)。取10.0g與試驗(yàn)樣品同質(zhì)材料不含抑菌成分的比照樣品浸泡2性比照。陽(yáng)性比照回收菌量為1.0×104CFU/片～9.0×104CFU/片。取同批次PBS、培育基作陰性比照。全部試驗(yàn)樣本和比照樣本均在36℃±1℃培育，細(xì)菌生殖體培育48h觀看結(jié)果；白色念珠菌培育72h觀看結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。5.1.2.4抑菌率計(jì)算%100010?-=AAAX...................................(2)式中：X—抑菌率，%；A0CFU/A1CFU/片。5.1.2.5抑菌率≥50%～90%，判有抑菌作用；抑菌率≥90%，判有較強(qiáng)抑菌作用。5.1.35.1.3.1適用于含溶出性抑菌成分的濕巾、無(wú)紡布口罩、衛(wèi)生巾、護(hù)墊、尿布等固體類(lèi)抑菌產(chǎn)品對(duì)微生物抑菌效果的測(cè)定。5.1.3.2試劑、培育基及器材見(jiàn)5.1.1.2。5.1.3.3試驗(yàn)步驟24hPBSPBS105CFU/mL～106CFU/mL，制成菌懸液備用。用滅菌剪刀在無(wú)菌條件下將試驗(yàn)樣品和比照樣品分別剪成20mm×30mm樣片備用。試驗(yàn)時(shí)滴加0.1mL菌懸液。比照樣片染菌前需經(jīng)壓力蒸汽滅菌。取無(wú)菌平皿，用無(wú)菌鑷子取220℃±1℃水浴5min，在每一樣片上滴加0.1mL試驗(yàn)用菌懸液，馬上計(jì)時(shí)。待試驗(yàn)菌與樣片接觸作用至5.0mLPBS試管中，混勻。振蕩洗脫，分別吸取1.0mL樣液，按活菌培育計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管樣液接種2個(gè)平皿。如平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)較多時(shí)，可10倍系列稀釋后，再進(jìn)展活菌培育計(jì)數(shù)。同時(shí)用與試驗(yàn)樣品同質(zhì)材料不含抑菌成分的比照樣片2片代替試驗(yàn)樣片進(jìn)展試驗(yàn)，作為陽(yáng)性比照，陽(yáng)性比照回收菌量為1.0×104CFU/片～9.0×104CFU/PBS、培育基作陰性比照。全部試驗(yàn)樣本和比照樣本均在 36℃±1℃培育，細(xì)菌生殖體培育48h、白色念珠菌培育72h觀看最終結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。5.1.3.4抑菌率計(jì)算見(jiàn)式〔2〕。5.1.3.5結(jié)果判定抑菌率≥50%～90%，判有抑菌作用；抑菌率≥90%，判有較強(qiáng)抑5.1.45.1.4.1適用于含溶出性抑菌物質(zhì)，可制成直徑為5mm片狀物的固體抑菌產(chǎn)品的抑菌效果鑒定；也可用于鑒別抗抑菌樣品中是否含有可溶性抑菌物質(zhì)。試劑、培育基及器材5.1.1.2試驗(yàn)步驟將試驗(yàn)菌24h穎斜面培育物用 PBS洗下，稀釋至5.0×105CFU/mL～5.0×106CFU/mL備用。抑菌片的制備：溶出性固體抑菌產(chǎn)品，直接制成直徑為 5mm，厚度不超過(guò)4mm圓片〔塊〕，每4片為一組。陰性比照樣片的制備：取同種材質(zhì)不含抑菌成分的樣本，制成與試驗(yàn)組大小一樣的圓片〔塊〕。用無(wú)菌棉拭子蘸取濃度為5.0×105CFU/mL～5.0×106CFU/mL試驗(yàn)菌懸液，在適宜的培育基平板外表均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)60°，最終將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿，置室5min。每次試驗(yàn)貼放1個(gè)染菌平板，每個(gè)平板貼放4片試驗(yàn)樣片，1片陰性比照樣片，共5片。用無(wú)菌鑷子取樣片貼放于平板外表，陰性比照樣片貼于平板中心位置，試驗(yàn)樣片貼于四周，貼放好后，用無(wú)菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板外表。各樣片中心之間相距25mm以上，15mm36℃±1℃培育16h～18h3用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑〔包括貼片〕并記錄，測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無(wú)菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)展，測(cè)量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。結(jié)果判定陰性比照樣片應(yīng)無(wú)抑菌環(huán)產(chǎn)生，試驗(yàn)樣品抑菌環(huán)直徑＞7mm者，判為有抑菌作用；抑菌環(huán)直徑≤7mm者，判為無(wú)抑菌作用。3次重復(fù)試驗(yàn)〔12個(gè)樣片〕均有抑菌作用，則判為合格。浸漬抑菌試驗(yàn)適用范圍適用于溶出性抑菌織物〔如抑菌毛巾、口罩、內(nèi)衣等〕抑菌效果的測(cè)定。試劑、培育基及器材5.1.5.2.1試驗(yàn)菌株見(jiàn)5.1.1.2.1試樣10cm以上、離布端1m以上部位，剪取直徑為5cm3份試樣分別裝于3個(gè)錐形瓶中，蓋好瓶口備用〔需用試樣數(shù)量要依據(jù)纖維類(lèi)別及織物織法而定，以能吸取1mL菌液且錐形瓶中不留殘液為度〕。另同法剪取與試樣一樣材質(zhì)但不含抑菌劑比照織物假設(shè)干，取2份分別裝于2個(gè)錐形瓶中，蓋好瓶口，121℃15min試劑和培育基0.03mol/LPBS〔pH7.2～7.4〕，肉湯培育基、養(yǎng)分瓊脂培育基、沙氏培育基。菌懸液的制備用接種環(huán)將保存的菌種以劃線法接種到養(yǎng)分瓊脂平板，36℃±1℃培育24h，取典型的菌落移種到含肉湯培育基的錐形瓶中，36℃±1℃培育24h，用肉湯對(duì)培育液進(jìn)展系列稀釋?zhuān)咕鷳乙旱暮繛?.0×105CFU/mL～5.0×105CFU/mL。5.1.5.3試驗(yàn)步驟1mL21物上，確保其均勻分布，且錐形瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸發(fā)造成細(xì)菌死亡。分別在一個(gè)盛有已接種菌懸液的試樣和比照織物的錐形瓶中參與100mLPBS，置渦旋振蕩器上振蕩1min洗滌細(xì)菌，分1.0mL102“0”接觸時(shí)間樣本和比照織物上的細(xì)菌數(shù)。將另一個(gè)裝有已接種菌懸液試樣的錐形瓶于36℃±1℃培育20h±2h，參與100mLPBS，置渦旋振蕩器上振蕩1min洗滌細(xì)菌，分別吸取1.0mL樣液或102個(gè)平皿，作為試驗(yàn)組。陰性比照組，試樣不接種菌懸液，在“0”接觸時(shí)間參與100mLPBS1min取樣，接種平皿。陽(yáng)性比照組，另取11mL36℃±1℃20h±2h，參與100mLPBS，置渦旋振蕩1min洗滌細(xì)菌，分別吸取1.0mL樣液或10接種2個(gè)平皿。將陰性和陽(yáng)性比照樣本與試驗(yàn)組樣本一并放36℃±1℃48h35.1.5.4計(jì)算抑菌率%1002/)][(C]2/)[(C?+-+=CBBACBBX或或或或(3)式中：X—抑菌率，%；ACFU/mL；B—“0”CFU/mL；C—“0”CFU/mL；假設(shè)“B”和“C”差異較大時(shí)，取較大值；假設(shè)“B”和“C”5.1.5.5試驗(yàn)成立條件要求：“0”接觸時(shí)間比照織物的平均回收菌量為1×103CFU/mL～5×103CFU/mL；陰性比照顧無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性比照菌數(shù)比0接觸時(shí)間的菌數(shù)明顯增加。各次試驗(yàn)的抑菌率均≥50%，即可判定該樣片具有抑菌作用。滯留抑菌效果試驗(yàn)5.1.6.1適用范圍適用于有持續(xù)抑菌作用的抑菌洗液類(lèi)抑菌產(chǎn)品的滯留抑菌效果鑒定。5.1.6.2試劑、培育基及試驗(yàn)器材試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌〔ATCC27217〕試驗(yàn)產(chǎn)品:試驗(yàn)品為25套按挨次編號(hào)的樣品。每套2瓶，一瓶為測(cè)試樣品，另一瓶為不含抗〔抑〕菌劑的比照樣品。不含抑菌劑的用品25瓶〔試驗(yàn)調(diào)整階段用〕。胰蛋白酶大豆肉湯培育基〔 TSB〕、胰蛋白酶大豆瓊脂培育基〔TSA〕、羊血、經(jīng)脫纖維處理、0.075mol/L70%酒精、金屬筒〔直徑2.2cm、高度3cm〕、一次性接種環(huán)〔直徑4mm〕、小塑料碗〔直徑2.2cm，高2.5mm,〕、膠帶〔Darapore,3M公司生產(chǎn)〕、尼龍刮菌棒、聚乙二醇單辛基苯基醚(曲拉通X-100；Triton-X100)500mL皮膚消毒劑等。5.1.試驗(yàn)步驟5.1.調(diào)整階段試驗(yàn)開(kāi)頭前7d至14d，受試者使用不含抗〔抑〕菌成分的香皂、洗發(fā)水和沐浴液進(jìn)展日常的洗手、洗澡，此階段持續(xù)至少7d，但不超14d。5.1.清洗階段清洗階段共3d，受試者每天用有持續(xù)抑菌作用的抑菌洗液類(lèi)樣品清洗一側(cè)前臂,用比照樣品清洗另一側(cè)前臂，清洗過(guò)程如下:先清洗左臂，用水溫為35℃～37℃的流淌水潤(rùn)濕前臂內(nèi)側(cè)；取樣液3mL60s；用流淌的清水沖洗前臂15s,不要搓擦；用紙巾沾干前臂，不要搓擦；用不含抑菌成分的比照樣品重復(fù)以上步驟清洗右臂；按上面所描述的試驗(yàn)步驟每日清洗前臂3次，每次間隔至少1h，在最終一次清洗之后，需記錄好時(shí)間，在12h之后,進(jìn)展滯留效果檢測(cè)。在第9次清洗前臂以后，受試者不能洗澡、淋浴或洗凈前臂，直到試驗(yàn)完畢。5.1.試驗(yàn)階段最終一次清洗后的12h或24h，將在受試者每只前臂上劃出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)，對(duì)試驗(yàn)區(qū)進(jìn)展接種、封包和回收存活細(xì)菌,具體步驟如下:將金黃色葡萄球菌〔ATCC27217〕33物接種于胰蛋白大豆肉湯培育基〔TSB〕中，在36℃±1℃的條件下培育20h±2h。然后用TSB適當(dāng)稀釋菌懸液，使菌懸液濃度約為108CFU/mL～109CFU/mL。接種:在受試者的每只前臂中間部位〔不要在手腕和肘皺褶處〕，用帶有印墨直徑為3.00cm的玻璃量筒扣在皮膚上，劃分出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)。使用加樣器取10μL上述菌懸液，接種于前臂試驗(yàn)區(qū)〔菌落數(shù)為106CFU/試驗(yàn)區(qū)～107CFU/試驗(yàn)區(qū)〕，用一次性接種環(huán)，把接種物涂4mm～5mm封包:細(xì)菌接種后馬上用小塑料碗扣于染菌區(qū)上面，再用膠帶將小塑料碗固定在皮膚上，記錄封包的時(shí)間?；厥沾婊罴?xì)菌:接種后2h±5min對(duì)前臂上接種的區(qū)域進(jìn)展取樣。將金屬筒放置于試驗(yàn)區(qū)中間部位，不要接觸到蓋有印墨的邊緣。將1mL含0.1%Triton-X100的0.075mol/L內(nèi)，用尼龍刮菌棒刮洗金屬筒罩住區(qū)域內(nèi)的皮膚60s,將筒內(nèi)液體吸移1mL含0.1%TritonX-1000.075mol/L磷酸鹽緩沖液，對(duì)該區(qū)域內(nèi)的皮膚進(jìn)展其次次刮洗30s，將其次次擦洗的液體，注入含第一次刮洗液體的試管中。試驗(yàn)區(qū)試驗(yàn)后的消毒處理:對(duì)抑菌樣品組清洗后的試驗(yàn)區(qū)采樣之后，需用70%的酒精對(duì)試驗(yàn)區(qū)進(jìn)展消毒。然后對(duì)無(wú)抑菌成分的比照組清洗后的試驗(yàn)區(qū)以同樣方法進(jìn)展采樣、消毒。試驗(yàn)完畢后，用皮膚消毒劑對(duì)兩只前臂進(jìn)展消毒處理，處理后清水沖洗，擦干，再涂少量的抗生素軟膏。接種與培育:對(duì)每一個(gè)取樣進(jìn)展接種，以0.0375mol/L磷酸鹽緩沖液對(duì)樣品進(jìn)展100.1mL接種于2個(gè)含5%羊血的TSA平板外表，用玻璃彎棒涂勻，在36℃±1℃的培育箱中培育48h±4h,計(jì)數(shù)菌落數(shù)。以試驗(yàn)同批次的稀釋液、培育基等分別設(shè)陰性比照。5.1.6.4抑菌率的計(jì)算%100?-=ABAX...................................(4)式中：X--抑菌率%A--比照平均菌落數(shù),單位為CFU/試驗(yàn)區(qū)B--試驗(yàn)平均菌落數(shù),單位為CFU/試驗(yàn)區(qū)5.1.6.5判定標(biāo)準(zhǔn)各次試驗(yàn)陰性比照菌無(wú)菌生長(zhǎng)。試驗(yàn)不得少于16人次，抑菌率均≥50%，可判定該產(chǎn)品在規(guī)定的5.2懸液定量殺菌試驗(yàn)5.2.1.1適用范圍適用于液體抗菌產(chǎn)品〔如液體抗菌液、抗菌噴霧劑等〕對(duì)微生物5.2.1.2中和劑(用PBS配制)，其它見(jiàn)5.1.1.2。5.2.1.3菌懸液配制取試驗(yàn)菌24h穎斜面培育物用PBS洗下，用PBS稀釋至約5.0×105CFU/mL～4.5×106CFU/mL菌懸液備用。5.2.1.4中和劑鑒定試驗(yàn)5.2.1.4.1分組15.0mL中和劑+0.1mL菌懸液→培育2〔0.5mL抗菌劑+4.5mL〕+0.1mL菌懸液→培育第35.0mL稀釋液+0.1mL菌懸液→培育第45.2.1.4.21組：取5.0mL中和劑，置20℃±1℃水浴中10min0.1mL勻，作用10min，用中和劑做10倍系列稀釋?zhuān)x適宜稀釋度分別吸1.0mL2第24.5mL0.5mL置20℃±1℃10min0.1mL混勻，作用10min，用中和產(chǎn)物做10倍系列稀釋?zhuān)x適宜稀釋度分1.0mL235.0mLPBS，置20℃±1℃10min，參與0.1mL試驗(yàn)菌懸液，混勻，作用10min，用PBS做101.0mL接種2第4組：分別吸取稀釋液〔PBS〕1.0mL15mL～20mL，作為陰性比照5.2.1.4.3第1、2、3組有相像量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，且菌量在1.0×104CFU/mL～9.0×104CFU/mL；計(jì)算組間菌落數(shù)誤差率，其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過(guò)15%；第4組無(wú)菌生長(zhǎng)，否則，說(shuō)明試劑有污染，應(yīng)更換無(wú)污染的試劑重進(jìn)展試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)均應(yīng)符合以上要求。5.2.1.5試驗(yàn)步驟取無(wú)菌試管，先參與5.0mL抗菌劑〔說(shuō)明書(shū)規(guī)定的使用濃度〕，置20℃±1℃水浴中5min后，再參與0.1mL試驗(yàn)用菌懸液，快速混勻并馬上計(jì)時(shí)。待試驗(yàn)菌與抗菌劑相互作用至各預(yù)定時(shí)間〔以說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間為T(mén)，時(shí)間分別為0.5T，T，1.5T〕，0.5mL試驗(yàn)菌與抗菌4.5mL各管試驗(yàn)菌與抗菌劑混合液經(jīng)中和劑作用 10min后，分別吸取1.0mL樣液，按活菌培育計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管樣液接種2個(gè)平皿。如平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)較多時(shí)，可用PBS進(jìn)展10倍系列稀釋后，再進(jìn)展活菌培育計(jì)數(shù)。同時(shí)用PBS代替消毒液，進(jìn)展平行試驗(yàn)，作為陽(yáng)性比照。陽(yáng)性比照1.0×104CFU/mL～9.0×104CFU/mL。取同批次稀釋液、中和劑、培育基作陰性比照。全部試驗(yàn)樣本和比照樣本均在36℃±1℃培育，對(duì)細(xì)菌生殖體培育48h觀看最終結(jié)果；對(duì)白色念珠菌需培育72h觀看最終結(jié)果。試驗(yàn)重35.2.1.6%100?-=ABAX...................................(5)式中：X—?dú)⒕剩?；ACFU/mL；B—試驗(yàn)組回收菌量，單位為CFU/mL。5.2.1.7結(jié)果判定說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間的殺菌率≥90%，判有抗菌作用；說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間的殺菌率≥99%，判為較強(qiáng)抗菌作用。載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)5.2.2.1適用范圍適用于粘稠狀〔半固體〕抗菌產(chǎn)品如抗菌洗手液、抗菌沐浴露、抗菌凝膠、膏狀抗菌產(chǎn)品等對(duì)微生物抗菌效果的鑒定。試劑、培育基及器材中和劑〔PBS配制〕，其它見(jiàn)5.1.2.2。染菌載體制備取試驗(yàn)菌24h穎斜面培育物用PBS洗下，用PBS稀釋至約5×106CFU/mL～5×107CFU/mL制成菌懸液備用。用微量移液器滴10μl，36℃±1℃烘干或室溫晾干備用。中和劑鑒定試驗(yàn)試驗(yàn)分組15.0mL中和劑+染菌載體→培育第2組：〔含抗菌劑的載體+5.0mL〕+染菌載體→培育35.0mL4組：稀釋液+中和劑+培育基→培育試驗(yàn)步驟依據(jù)試驗(yàn)分組，預(yù)備試管和平皿，依次進(jìn)展編號(hào)。15.0mL20℃±1℃水浴5min，參與1片染菌載體，作用10min，取出菌片放入5.0mL中和劑試管內(nèi)，作用10min后，置渦旋振蕩器上振蕩1min或在手掌上用力振打80次，將試驗(yàn)菌洗下，用中和劑做10倍系列稀釋后，選擇適宜稀釋1.0mL2第2組：取5.0mL1片沾有抗菌樣本的載體，混勻，置20℃±1℃水浴作用10min制成中和產(chǎn)物。再用無(wú)菌鑷子取1片染菌載體，浸于中和產(chǎn)物中作用10min后，用無(wú)菌鑷子取出染菌載體移入含5.0mL10min，振蕩，將試驗(yàn)菌洗下，用中和產(chǎn)物做10倍系列稀釋,選適宜稀釋度分別吸取1.0mL235.0mLPBS20℃±1℃水浴5min，參與110min，取出菌片放入5.0mLPBS作用10min后，振蕩，將試驗(yàn)菌洗下，用PBS做101.0mL2第4組：分別吸取稀釋液〔PBS〕與中和劑各1.0mL于同一無(wú)菌15～20mL，培育觀看。結(jié)果判定第1、2和3組有相像量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，且菌量在1.0×104CFU/片～9.0×104CFU/片。計(jì)算組間菌落數(shù)誤差率，其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過(guò)15%。第4組無(wú)菌生長(zhǎng),否則，說(shuō)明試劑有污染，應(yīng)更換無(wú)污染的3次，每次試驗(yàn)均應(yīng)符合以上要求。試驗(yàn)步驟按5g/片的量稱取抗菌樣品于無(wú)菌平皿內(nèi)，置20℃±1℃水浴5min，用無(wú)菌鑷子取染菌載體，使載體完全浸沒(méi)于抗菌樣品中，馬上計(jì)時(shí)。待染菌載體與抗菌劑相互作用至各預(yù)定時(shí)間〔以說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間為T(mén)，時(shí)間分別為0.5T，T，1.5T〕，分別取染菌載體參與5.0mL中和劑試管中，混勻。經(jīng)中和劑作用10min后，振蕩，將試驗(yàn)菌洗下，分別吸取1.0mL樣液，按活菌培育計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管樣液接種2個(gè)平皿。如平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)較多時(shí)，可用PBS進(jìn)展系列10倍稀釋后，再進(jìn)行活菌培育計(jì)數(shù)。取與試驗(yàn)樣品同質(zhì)材料不含抗菌成分的比照樣品代替抗菌樣品浸2作為陽(yáng)性比照。陽(yáng)性比照回收菌量為1.0×104CFU/片～9.0×104CFU/片。取同批次稀釋液、中和劑、培育基作陰性比照。全部試驗(yàn)樣本和比照樣本均在36℃±1℃培育，細(xì)菌生殖體培育48h觀看結(jié)果；白色念珠菌培育72h觀看結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算5.2.2.6%100?-=ABAX...................................(6)式中：X—?dú)⒕剩?；ACFU/片；B—試驗(yàn)樣本回收菌量，單位為CFU/片。5.2.2.7結(jié)果判定說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間的殺菌率≥90%，判有抗菌作用；說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間的殺菌率≥99%，判有較強(qiáng)抗菌作用。載體殺菌試驗(yàn)5.2.3.1適用范圍適用于添加有殺菌劑的衛(wèi)生濕巾或可溶性抗菌物質(zhì)的載體類(lèi)產(chǎn)品5.2.3.2試劑、培育基及器材中和劑〔PBS配制〕，其它見(jiàn)5.1.1.25.2.3.3菌懸液配制及樣片制備取試驗(yàn)菌 24h穎斜面培育物用 PBS洗下，用 PBS稀釋至1.0×105CFU/mL～9.0×105CFU/mL，制成菌懸液備用。用無(wú)菌剪刀將抗菌產(chǎn)品和材質(zhì)一樣但不含抗菌成分的比照樣品分別剪成20mm×30mm樣片備用。試驗(yàn)時(shí)滴加0.1mL菌懸液。比照樣片染菌前需經(jīng) 121℃15min滅菌處理。 5.2.3.4中和劑鑒定試驗(yàn)5.2.3.4.1試驗(yàn)分組15.0mL中和劑+染菌比照樣片→培育2〔