高通量測序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應用-課件

高通量測序技術(shù)在腫瘤診斷與個體化治療中的應用高通量測序技術(shù)在腫瘤診斷與個體化治療中的應用1腫瘤是一種基因病基因過表達與突變同病異突變傳統(tǒng)突變檢測的局限性NGS腫瘤是一種基因病基因過表達與突變同病異突變傳統(tǒng)突變檢測的局限2測序的歷史測序的歷史3高通量測序:一次性對幾百萬到十億條DNA分子進行并行測序，又稱為下一代測序技術(shù)，其使得可對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行深入、細致、全貌的分析，所以又被稱為深度測序。High-throughputSequencingNextGenerationSequencingDeepSequencing高通量測序簡介（NGS）高通量測序:一次性對幾百萬到十億條DNA分子進行并行測序，又4文庫擴增低通量Sanger測序高通量測序并行測序

高通量無需建立文庫，

兩端加測序接頭PCR擴增文庫擴增低通量Sanger測序高通量5ExomesequencingTranscriptomesequencingGenomesequencingTargeted

sequencinga:Roche/454,Life/APG,Polonatorb:Illumina/SolexaSolid-Phaseamplificationc:AppliedBiosystemsSOLiDsystemd:HelicosBiosciences:onepassExomesequencingTranscriptome6454測序流程454測序流程7IlluminaSolexa測序流程IlluminaSolexa測序流程8ABISOLiD測序原理ABISOLiD測序原理9三種平臺的技術(shù)差異三種平臺的技術(shù)差異101.對于研究區(qū)域比較嚴格定義的時候，Agilent平臺更適合。2.Illumina平臺能夠捕獲UTR區(qū)域，其他平臺不行。3.Agilent能檢測到最多的SNP及插入缺失。1.對于研究區(qū)域比較嚴格定義的時候，Agilent平臺更適合11科研應用（潛在臨床應用前景）科研應用（潛在臨床應用前景）12高通量測序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應用--課件13外顯子組測序ExomeSequencingAllowsforRapidGeneIdentificationinaCharcot-Marie-ToothFamilyAnnualNeurology冰桶挑戰(zhàn)讓我們進一步認識了進行性神經(jīng)性肌萎縮綜合征。全外顯子測序分析了這一罕見家系存在的基因突變類型

（罕見病家系）外顯子組測序ExomeSequencingAllows1410HBV（+）HCCwithPVTTsandmatchedcontrolsIllumina/Solexasequencing

ABISOLiDsequencing

Identificationofcandidatesomaticmutations.

Identificationofsomaticindels

PCR-basedSangerresequencing.

10HBV（+）HCCwithPVTTsandm15高通量測序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應用--課件16高通量測序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應用--課件17基因組DNA打斷外顯子捕獲富集文庫建立測序原始數(shù)據(jù)下機數(shù)據(jù)過濾質(zhì)控ShootingGun參考序列無有Indel,SNP統(tǒng)計氨基酸突變研究GO功能分析KEGG通路分析測序深度評估測序覆蓋度評估測序隨機性評估分析內(nèi)容測序評估基因組DNA打斷外顯子捕獲富集文庫建立測序原始數(shù)據(jù)下機數(shù)據(jù)過18外顯子組測序WeiX,

WaliaV,

etal.ExomesequencingidentifiesGRIN2Aasfrequentlymutatedinmelanoma.NatGenet黑色素瘤發(fā)生率一直在上升，此研究對黑色素瘤細胞進行外顯子組捕獲測序，發(fā)現(xiàn)了和其相關(guān)的高頻突變基因。（某種類型疾病與暴露因素相關(guān)性研究）外顯子組測序WeiX,

WaliaV,

etal.E19基因組DNA打斷外顯子捕獲富集文庫建立測序原始數(shù)據(jù)下機數(shù)據(jù)過濾質(zhì)控ShootingGun參考序列無有Indel,SNP統(tǒng)計氨基酸突變研究GO功能分析KEGG通路分析測序深度評估測序覆蓋度評估測序隨機性評估分析內(nèi)容測序評估基因組DNA打斷外顯子捕獲富集文庫建立測序原始數(shù)據(jù)下機數(shù)據(jù)過20七個新發(fā)現(xiàn)的非同義高頻突變位點七個新發(fā)現(xiàn)的非同義高頻突變位點21單個基因中突變位點分析基因GRIN2A模式圖，箭頭表示突變位點單個基因中突變位點分析基因GRIN2A模式圖，箭頭表示突變位22高通量測序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應用--課件23Whatcan/wouldwedo?Whatcan/wouldwedo?24基于全外顯子測序的家族遺傳性腫瘤疾病易感性研究（以下以胃癌為例）胃癌（GastricCancer）全球：第四大常見癌癥；第二大癌癥死亡率平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女發(fā)病率2:1中國：惡性腫瘤中居首位，西北與東南沿海地區(qū)發(fā)病率更高風險：家族遺傳、HP、飲食結(jié)構(gòu)、癌前胃部疾病、吸煙等家族遺傳因素：胃癌病人親屬的胃癌發(fā)病率較普通人高4倍以上

10%胃癌在家族中遺傳

1%-3%為CDH1基因突變帶來的家族彌漫性胃癌，其他原因目前未知罕見類型或特殊病理類型！基于全外顯子測序的家族遺傳性腫瘤疾病易感性研究（以下以胃癌為25家族性胃癌是指：高發(fā)病率區(qū)(如中國)一級和(或)二級親屬中≥3例患病其中1例是另2例的一級親屬連續(xù)兩代發(fā)病至少有1例發(fā)病年齡＜50歲。家族性胃癌是指：26突破點在于：1、發(fā)現(xiàn)罕見疾病家系2、收集完整家族血液樣本3、剔除抑制突變、SNP及同義突變4、發(fā)現(xiàn)新的突變>SNP>copynumber突破點在于：27肥胖與HP（+）胃癌的關(guān)系研究胃癌（GastricCancer）全球：第四大常見癌癥；第二大癌癥死亡率平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女發(fā)病率2:1中國：惡性腫瘤中居首位，西北與東南沿海地區(qū)發(fā)病率更高風險：家族遺傳、HP、飲食結(jié)構(gòu)、癌前胃部疾病、吸煙等家族遺傳因素：肥胖和腫瘤是全球兩大重要的公共衛(wèi)生問題。肥胖可以增加胃癌罹患率,并且治療效果差、腫瘤病死率高,但具體機制尚不清楚。

肥胖與胃癌均存在一定家族遺傳性肥胖與HP（+）胃癌的關(guān)系研究胃癌（GastricCan28全外顯子捕獲測序獲得初篩數(shù)據(jù)Step1Step2Step3先證者母親父親DNA/RNAExtractionNext-generationSequencing數(shù)據(jù)庫比對SNV、indelanalysis、mutantgenesRT-PCR、IHCoftargetgenesintissuesofproband功能研究BloodSamplesInvitro/vivostudy5TrioswithHP（+）TissuesTRIO家庭三口之家全外顯子捕獲測序獲得初篩數(shù)據(jù)Step1Step2Step29肥胖的定義1.BMI:<25kg/㎡normal25~30kg/㎡overweight

>30kg/㎡obesity2.WHRorWHtR（waist-to-hipratioorwaist-toheightratio

Male：>0.95obesityFemale：>0.8obesity三人同時滿足！肥胖的定義1.BMI:<25kg/㎡30HP（+）的定義胃鏡取活檢標本檢查，分離培養(yǎng)+直接涂片檢查+病理切片未經(jīng)任何治療胃癌的定義胃鏡取活檢標本檢查，病理檢測未經(jīng)任何治療腺癌(包括乳頭狀腺癌、管狀腺癌、粘液腺癌、印戒細胞癌)

先證者一人滿足！C14呼氣試驗能否確診HP（+）？HP（+）的定義胃鏡取活檢標本檢查，分離培養(yǎng)+直接涂片檢查+31實驗組對照組3-5TRIOs肥胖家庭非肥胖家庭HP（+）外顯子測序普通測序驗證DeNovo突變體外及動物實驗3-5TRIOsHP（+）外顯子測序普通測序驗證DeNovo突變體外及動物實驗其他標準：性別比TNM分期先證者年齡實驗組對照組3-5TRIOs肥胖家庭非肥胖家庭HP（+）外32質(zhì)控標本采集：TRIO全血采集（與測序公司討論所需血樣體積），采用抗凝管DNA提?。≦IAmpDNABloodMinikit）及保存（1）樣品純度：OD260/280值應在1.8～2.0之間；RNAfree。

（2）樣品濃度：最低濃度不低于50ng/μl。

（3）樣品總量：每個樣品總量不少于15μg。

（4）樣品溶劑：溶解在H20或TE（pH8.0）中。

（5）保存：DNA低溫運輸（-20℃，干冰）質(zhì)控標本采集：TRIO全血采集（與測序公司討論所需血樣體積）33臨床應用臨床應用34高通量測序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應用--課件35高通量測序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應用--課件36基于測序的腫瘤個人疾病ID建立與個體化治療方案癌癥突變用藥數(shù)據(jù)庫其他優(yōu)勢數(shù)萬份案例臨床實驗數(shù)據(jù)庫NCCN及FDA數(shù)據(jù)庫結(jié)合人群用藥情況（中國）專人監(jiān)測，實時更新血液樣本監(jiān)測遺傳信息監(jiān)測二/三期臨床藥物推薦私人訂制！基于測序的腫瘤個人疾病ID建立與個體化治療方案癌癥突變用藥數(shù)37石蠟包埋組織切片或組織塊新鮮冰凍組織血液和骨髓其他檢測流程石蠟包埋組織切片或組織塊檢測流程38CDKVEGF損傷修復基因MDM2反饋調(diào)節(jié)p21切斷腫瘤血供GD-AIFBAI-1TSP血管生成因