拉曼光譜分析技術(shù)課件

拉曼光譜分析技術(shù)元拉曼光譜分析技術(shù)元1拉曼光譜分析技術(shù)拉曼光譜概述1拉曼光譜的基本原理2激光拉曼光譜儀3拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展4拉曼光譜分析技術(shù)拉曼光譜概述1拉曼光譜的基本原理2激光拉曼光21拉曼光譜概述

1928年印度物理學(xué)家C.V.拉曼在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光穿過透明介質(zhì)被分子散射的光發(fā)生頻率變化，這一現(xiàn)象稱為拉曼散射，本人也因此榮獲1930年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。1.1拉曼光譜的發(fā)展歷程拉曼發(fā)明的拉曼光譜儀1拉曼光譜概述1.1拉曼光譜的發(fā)展歷程拉曼發(fā)明的拉曼31928~1940年，受到廣泛的重視，曾是研究分子結(jié)構(gòu)的主要手段。這是因?yàn)榭梢姽夥止饧夹g(shù)和照相感光技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來的緣故；1940~1960年，拉曼光譜的地位一落千丈。主要是因?yàn)槔?yīng)太弱（約為入射光強(qiáng)的10-6），并要求被測樣品的體積必須足夠大、無色、無塵埃、無熒光等等。所以到40年代中期，紅外技術(shù)的進(jìn)步和商品化更使拉曼光譜的應(yīng)用一度衰落；1960年以后，激光技術(shù)的發(fā)展使拉曼技術(shù)得以復(fù)興。由于激光束的高亮度、方向性和偏振性等優(yōu)點(diǎn)，成為拉曼光譜的理想光源。隨探測技術(shù)的改進(jìn)和對被測樣品要求的降低，目前在物理、化學(xué)、醫(yī)藥、工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域拉曼光譜得到了廣泛的應(yīng)用，越來越受研究者的重視。1928~1940年，受到廣泛的重視，曾是研究分子結(jié)構(gòu)的主要41.2拉曼光譜技術(shù)的優(yōu)越性提供快速、簡單、可重復(fù)且更重要的是無損傷的定性定量分析，它無需樣品準(zhǔn)備，樣品可直接通過光纖探頭或者通過玻璃、石英和光纖測量。此外

1）

由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光譜是研究水溶液中的生物樣品和化學(xué)化合物的理想工具。

2）

拉曼光譜一次可同時(shí)覆蓋50-4000波數(shù)的區(qū)間，可對有機(jī)物及無機(jī)物進(jìn)行分析。相反，若讓紅外光譜覆蓋相同的區(qū)間則必須改變光柵、光束分離器、濾波器和檢測器1.2拉曼光譜技術(shù)的優(yōu)越性提供快速、簡單、可重復(fù)且更重要的53）

拉曼光譜譜峰清晰尖銳，更適合定量研究、數(shù)據(jù)庫搜索以及運(yùn)用差異分析進(jìn)行定性研究。在化學(xué)結(jié)構(gòu)分析中，獨(dú)立的拉曼區(qū)間的強(qiáng)度可以和功能集團(tuán)的數(shù)量相關(guān)。

4）

因?yàn)榧す馐闹睆皆谒木劢共课煌ǔＶ挥?.2-2毫米，常規(guī)拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得到。這是拉曼光譜相對常規(guī)紅外光譜一個(gè)很大的優(yōu)勢。

5）

共振拉曼效應(yīng)可以用來有選擇性地增強(qiáng)大生物分子某個(gè)發(fā)色基團(tuán)的振動，這些發(fā)色基團(tuán)的拉曼光強(qiáng)能被選擇性地增強(qiáng)1000到10000倍。3）拉曼光譜譜峰清晰尖銳，更適合定量研究、數(shù)61.3幾種重要的拉曼光譜分析技術(shù)1、單道檢測的拉曼光譜分析技術(shù)2、以CCD為代表的多通道探測器用于拉曼光譜的檢測儀的分析技術(shù)3、采用傅立葉變換技術(shù)的FT-Raman光譜分析技術(shù)4、共振拉曼光譜分析技術(shù)5、表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)分析技術(shù)1.3幾種重要的拉曼光譜分析技術(shù)1、單道檢測的拉曼光譜分析7拉曼光譜分析技術(shù)2拉曼光譜的基本原理拉曼光譜分析技術(shù)2拉曼光譜的基本原理82拉曼光譜的基本原理光的瑞利散射和拉曼散射一束頻率為ν0的單色光，當(dāng)它不能被照射的物體吸收時(shí)，大部分光將沿入射光束通過樣品，約1/105～1/106有強(qiáng)度的光被散射到各個(gè)方向，并在與入射方向垂直的方向，可以觀察到兩種散射。●瑞利散射為光與樣品分子間的彈性碰撞，光子的能量或頻率不變，只改變了光子運(yùn)動的方向?！窭⑸錇楣馀c樣品分子間的非彈性碰撞，光子的能量或頻率以及方向都發(fā)生變化。瑞利散射λ不變拉曼散射λ變化2.1瑞利散射和拉曼散射2拉曼光譜的基本原理光的瑞利散射和拉曼散射瑞利散射λ不變拉9樣品池透過光λ不變?nèi)鹄⑸洇瞬蛔兝⑸洇俗儲嗽龃螃藴p小樣透過光λ不變?nèi)鹄⑸洇瞬蛔兝⑸洇俗儲嗽龃螃藴p小10CCl4的拉曼光譜Stockslinesanti-StockeslinesRayleighscatteringΔν/cm-1CCl4的拉曼光譜Stockslinesanti-Sto11

拉曼效應(yīng)的機(jī)制和熒光現(xiàn)象不同，并不吸收激發(fā)光，因此不能用實(shí)際的上能級來解釋，玻恩和黃昆用虛的上能級概念說明拉曼效應(yīng)。假設(shè)散射物分子原來處于電子基態(tài)，振動能級如上圖所示。當(dāng)受到入射光照射時(shí)，激發(fā)光與此分子的作用引起極化可以看作虛的吸收，表述為躍遷到虛態(tài)虛能級上的電子立即躍遷到下能級而發(fā)光，即為散射光。存在如圖所示的三種情況，散射光與入射光頻率相同的譜線稱為瑞利線，與入射光頻率不同的譜線稱為拉曼線。拉曼效應(yīng)的機(jī)制和熒光現(xiàn)象不同，并不吸收激發(fā)光，因此不能用實(shí)12Rayleigh散射：

彈性碰撞；無能量交換，僅改變方向；Raman散射：

非彈性碰撞；方向改變且有能量交換；Rayleigh散射Raman散射E0基態(tài)，E1振動激發(fā)態(tài)；E0+h

0，

E1+h

0激發(fā)虛態(tài)；獲得能量后，躍遷到激發(fā)虛態(tài).

h

E0E1V=1V=0h

0h

0h

0h

0

+

E1+h

0E0+h

0h(

0

-

)激發(fā)虛態(tài)Rayleigh散射：Rayleigh散射Raman散射E0132.2拉曼效應(yīng)

拉曼效應(yīng)為光子與樣品中分子的非彈性碰撞，即光子與分子相互作用中有能量的交換。入射光子的能量為hν0，當(dāng)與分子碰撞后，可能出現(xiàn)兩種情況：●第一種是分子處于基態(tài)振動能級，與光子碰撞后，分子從入射光子獲取確定的能量h

ν達(dá)到較高的能級。則散射光子的能量變?yōu)閔（ν0－

ν）=hν，頻率降低至ν0－

ν，形成頻率為ν0－

ν的譜線?！窳硪环N是分子處于激發(fā)態(tài)振動能級，與光子碰撞后，分子躍遷回基態(tài)而將確定的能量h

ν傳給光子。則散射光子的能量變?yōu)閔（ν0＋

ν）=hν，頻率增加至ν0＋

ν，形成頻率為ν0＋

ν的譜線?！駜煞N情況，散射光子的頻率都發(fā)生變化了，減小或增加了。2.2拉曼效應(yīng)拉曼效應(yīng)為光子與樣品中分子的非彈性碰14

Raman散射Raman散射的兩種躍遷能量差：

E=h(

0-

)

E=h(

0+

)h(

0

+

)E0E1V=1V=0E1+h

0E2+h

0

h

h

0h(

0

-

)Raman散射h(0+)E0E1V=1V=015Stokes線與反Stokes線●將負(fù)拉曼位移，光子失去能量，頻率減小，即ν0－

ν稱為Stokes線（斯托克斯線）。●將正拉曼位移，光子得到能量，頻率增大，即ν0＋

ν稱為反Stokes線（反斯托克斯線）。正負(fù)拉曼位移線的躍遷幾率是相等的，但由于反斯托克斯線起源于受激振動能級，處于這種能級的粒子數(shù)很少，因此反斯托克斯線的強(qiáng)度小，而斯托克斯線強(qiáng)度較大，在拉曼光譜分析中主要應(yīng)用的譜線。Stokes線與反Stokes線●將負(fù)拉曼位移，光子失去能量162.3拉曼位移Raman位移：Raman散射光與入射光頻率差；ANTI-STOKES

0-

RayleighSTOKES

0+

0

=|

0–

s|

取決于分子振動能級的改變，因此是特征的2.3拉曼位移Raman位移：Raman散射光與入射光頻率17拉曼位移的特點(diǎn)

對不同物質(zhì)：

不同；

對同一物質(zhì)：

與入射光頻率無關(guān)；只與分子振動或轉(zhuǎn)動頻率有關(guān)，表征分子振-轉(zhuǎn)能級的特征物理量；定性與結(jié)構(gòu)分析的依據(jù)

拉曼位移的特點(diǎn)對不同物質(zhì)：不同；18拉曼位移產(chǎn)生的條件

拉曼散射不要求有偶極矩的變化，卻要求有極化率的變化，與紅外光譜不同，也正是利用它們之間的差別，兩種光譜可以互為補(bǔ)充。

分子在靜電場E中，如光波交變電磁場分子中產(chǎn)生了感應(yīng)偶極距p正極負(fù)極核電子P=αEα—分子的極化率拉曼位移產(chǎn)生的條件拉曼散射不要求有偶極矩的變化，卻要求19拉曼光譜與分子極化率的關(guān)系

P=αEα—分子的極化率感應(yīng)偶極矩與外電場的強(qiáng)度之比為分子極化率分子中兩原子距離最大時(shí)，α也最大拉曼散射強(qiáng)度與極化率成正比例關(guān)系拉曼光譜與分子極化率的關(guān)系202.4拉曼散射光譜的特征拉曼散射光譜具有以下明顯的特征

a.拉曼散射譜線的波數(shù)雖然隨入射光的波數(shù)而不同，但對同一樣品，同一拉曼譜線的位移與入射光的波長無關(guān),只與樣品的振動轉(zhuǎn)動能級有關(guān)；

b.在以波數(shù)為變量的拉曼光譜圖上，斯托克斯線和反斯托克斯線對稱地分布在瑞利散射線兩側(cè),這是由于在上述兩種情況下分別相應(yīng)的得到或失去了一個(gè)振動量子的能量。2.4拉曼散射光譜的特征拉曼散射光譜具有以下明顯的特征21c.一般情況下，斯托克斯線比反斯托克斯線的強(qiáng)度大。這是由于Boltzmann分布，處于振動基態(tài)上的粒子數(shù)遠(yuǎn)大于處于振動激發(fā)態(tài)上的粒子數(shù)。c.一般情況下，斯托克斯線比反斯托克斯線的強(qiáng)度大。這是222.5拉曼散射光譜的優(yōu)缺點(diǎn)(1)拉曼光譜是一個(gè)散射過程，因而任何尺寸、形狀、透明度的樣品，只要能被激光照射到，就可直接用來測量。由于激光束的直徑較小，且可進(jìn)一步聚焦，因而極微量樣品都可測量。(2)水是極性很強(qiáng)的分子，因而其紅外吸收非常強(qiáng)烈。但水的拉曼散射卻極微弱，因而水溶液樣品可直接進(jìn)行測量，這對生物大分子的研究非常有利。

(3)對于聚合物及其他分子，拉曼散射的選擇定則的限制較小，因而可得到更為豐富的譜帶。S—S，C—C，C=C，N=N等紅外較弱的官能團(tuán)，在拉曼光譜中信號較為強(qiáng)烈。拉曼光譜研究高分子樣品的最大缺點(diǎn)是熒光散射。2.5拉曼散射光譜的優(yōu)缺點(diǎn)(1)拉曼光譜是一個(gè)散射過程，因23發(fā)光（熒光）的抑制和消除在拉曼光譜測試中，往往會遇到熒光的干擾，由于拉曼散射光極弱，所以一旦樣品或雜質(zhì)產(chǎn)生熒光，拉曼光譜就會被熒光所淹沒。通常熒光來自樣品中的雜質(zhì)，但有的樣品本身也可發(fā)生螢光，常用抑制或消除螢光的方法有以下幾種:發(fā)光（熒光）的抑制和消除在拉曼光譜測試中，往往會遇到熒光的干24（1）純化樣品（2）強(qiáng)激光長時(shí)間照射樣品（3）加熒光淬滅劑有時(shí)在樣品中加入少量熒光淬滅劑，如硝基苯，KBr,AgI等，可以有效地淬滅熒光干擾。（1）純化樣品25（4）利用脈沖激光光源當(dāng)激光照射到樣品時(shí)，產(chǎn)生熒光和拉曼散射光的時(shí)間過程不同，若用一個(gè)激光脈沖照射樣品，將在10-11∽10-13S內(nèi)產(chǎn)生拉曼散射光，而熒光則是在10-7∽10-9S后才出現(xiàn)。(5)改變激發(fā)光的波長以避開熒光干擾在測量拉曼光譜時(shí)，對于不同的激發(fā)光拉曼譜帶的相對位移是不變的，熒光則不然，對于不同的激發(fā)光，熒光的相對位移是不同的。所以選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光，可避開熒光的干擾。在實(shí)際工作中常用這一方法識別熒光峰。（4）利用脈沖激光光源262.6拉曼光譜與紅外光譜比較

拉曼光譜與紅外光譜互稱為姊妹譜。因此，可以相互補(bǔ)充。①

相似之處：

a激光拉曼光譜與紅外光譜一樣，都能提供分子振動頻率的信息，對于一個(gè)給定的化學(xué)鍵，其紅外吸收頻率與拉曼位移相等，均代表第一振動能級的能量。b拉曼光譜的分析方法與紅外光譜相似2.6拉曼光譜與紅外光譜比較拉曼光譜與紅外光譜互稱為姊27②不同之處：a紅外光譜的入射光及檢測光都是紅外光，而拉曼光譜的入射光和散射光大多是可見光。拉曼效應(yīng)為散射過程，拉曼光譜為散射光譜，紅外光譜對應(yīng)的是與某一吸收頻率能量相等的（紅外）光子被分子吸收，因而紅外光譜是吸收光譜。②不同之處：28b機(jī)理不同：從分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化的角度看，拉曼散射過程來源于分子的誘導(dǎo)偶極矩，與分子極化率的變化相關(guān)。通常非極性分子及基團(tuán)的振動導(dǎo)致分子變形，引起極化率的變化，是拉曼活性的。紅外吸收過程與分子永久偶極矩的變化相關(guān)，一般極性分子及基團(tuán)的振動引起永久偶極矩的變化，故通常是紅外活性的。c制樣技術(shù)不同：紅外光譜制樣復(fù)雜，拉曼光譜勿需制樣，可直接測試水溶液。b機(jī)理不同：從分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化的角度看，拉曼散射過程來源于29拉曼光譜與紅外光譜分析方法比較拉曼光譜與紅外光譜分析方法比較30拉曼光譜分析技術(shù)3激光拉曼光譜儀拉曼光譜分析技術(shù)3激光拉曼光譜儀31激光拉曼光譜儀示意圖激光拉曼光譜儀示意圖323.1儀器組成激光拉曼光譜儀主要由光源、外光路系統(tǒng)、色散系統(tǒng)、接收系統(tǒng)和檢測記錄系統(tǒng)五大部分組成。3激光拉曼光譜儀3.1儀器組成激光拉曼光譜儀主要由光源、外光路系統(tǒng)、色散系33光源它的功能是提供單色性好、功率大并且最好能多波長工作的入射光。目前拉曼光譜實(shí)驗(yàn)的光源己全部用激光器代替歷史上使用的汞燈。對常規(guī)的拉曼光譜實(shí)驗(yàn)，常見的氣體激光器基本上可以滿足實(shí)驗(yàn)的需要，常用氬離子激光器。最常用的兩條激發(fā)線的波長分別為

514.5nm和

488.0nm。光源它的功能是提供單色性好、功率大并且最好能多波長工作的入射34外光路系統(tǒng)外光路部分包括聚光、集光、樣品架．濾光和偏振等部件。

(1)聚光：用一塊或二塊焦距合適的匯聚透鏡，使樣品處于匯聚激光束的中部，以提高樣品光的輻照功率，可使樣品在單位面積上輻照功率比不用透鏡匯聚前增強(qiáng)105倍。

(2)集光：常用透鏡組或反射凹面鏡作散射光的收集鏡。通常是由相對孔徑數(shù)值在1左右的透鏡組成。為了更多地收集散射光，對某些實(shí)驗(yàn)樣品可在集光鏡對面和照明光傳播方向上加反射鏡。外光路系統(tǒng)外光路部分包括聚光、集光、樣品架．濾光和偏振等部件35

(3)樣品架：樣品架的設(shè)計(jì)要保證使照明最有效和雜散光最少，尤其要避免入射光進(jìn)入光譜儀的入射狹縫。

(4)濾光：安置濾光部件的主要目的是為了抑制雜散光以提高拉曼散射的信噪比。

(5)偏振：做偏振譜測量時(shí)，必須在外光路中插入偏振元件。加入偏振旋轉(zhuǎn)器可以改變?nèi)肷涔獾钠穹较颉?/p>

(3)樣品架：樣品架的設(shè)計(jì)要保證使照明最有效和雜散光最36色散系統(tǒng)色散系統(tǒng)使拉曼散射光按波長在空間分開，通常使用單色儀。主要作用是減少雜散光對測量的干擾，之后進(jìn)入光電倍增管。

單色儀是拉曼光譜儀的心臟，要求環(huán)境清潔，灰塵對單色儀的光學(xué)元件鏡面的玷污是嚴(yán)重的，必要時(shí)要用洗耳球吹拂去鏡面上的灰塵，但切忌用粗糙的濾紙或布抹擦，以免劃破光學(xué)鍍膜。色散系統(tǒng)色散系統(tǒng)使拉曼散射光按波長在空間分開，通常使用單色儀37接收系統(tǒng)拉曼散射信號的接收類型分單通道和多通道接收兩種。

光電倍增管接收屬于單通道接收。檢測記錄系統(tǒng)為了提取拉曼散射信息，常用的電子學(xué)處理方法是直流放大、選頻和光子計(jì)數(shù)，然后用記錄儀或計(jì)算機(jī)接口軟件畫出圖譜。接收系統(tǒng)拉曼散射信號的接收類型分單通道和多通道接收兩種。檢測383.2激光拉曼光譜儀激光光源：He-Ne激光器，波長632.8nm

Ar激光器，

波長514.5nm，

488.0nm；散射強(qiáng)度

1/4

單色器：光柵，多單色器；檢測器：光電倍增管，光子計(jì)數(shù)器；3.2激光拉曼光譜儀激光光源：He-Ne激光器，波長632393.3傅立葉變換-拉曼光譜儀

FT-Ramanspectroscopy光源：Nd-YAG（釹-釔鋁石榴石）激光器；檢測器：高靈敏度的銦鎵砷探頭；特點(diǎn)：（1）避免了熒光干擾；（2）精度高；（3）消除了瑞利譜線；（4）測量速度快。3.3傅立葉變換-拉曼光譜儀

FT-Ramansp40拉曼光譜分析技術(shù)4拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展拉曼光譜分析技術(shù)4拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展414.1拉曼光譜的應(yīng)用拉曼光譜分析技術(shù)是以拉曼效應(yīng)為基礎(chǔ)建立起來的分子結(jié)構(gòu)表征技術(shù)，其信號來源于分子的振動和轉(zhuǎn)動。拉曼光譜的分析方向有以下三方面。定性分析：不同的物質(zhì)具有不同的特征光譜，因此可以通過光譜進(jìn)行定性分析。結(jié)構(gòu)分析：對光譜譜帶的分析，又是進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)。定量分析：根據(jù)物質(zhì)對光譜的吸光度的特點(diǎn)，可以對物質(zhì)的量有很好的分析能力。4拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展4.1拉曼光譜的應(yīng)用拉曼光譜分析技術(shù)是以拉曼效應(yīng)為基礎(chǔ)建立42水果表面殘留農(nóng)藥的監(jiān)測水果表面殘留農(nóng)藥的監(jiān)測43從不同種類的水果表面得到的拉曼光譜可以看出，除了水果原本的拉曼峰外，農(nóng)藥的殘留能清晰地顯示出來，這表明這一方法是靈敏而適用的。定量地分析農(nóng)藥殘留可以從農(nóng)藥特征譜線和水果特征譜線的相對強(qiáng)度比獲得。從不同種類的水果表面得到的拉曼光譜可以看出，除了水果原本的拉44生物分子鑒定拉曼光譜法對于蛋白質(zhì)中的酪胺酸可以偵