ctDNA簡介與Illumina平臺文庫構建簡介

ctDNA簡介與Illumina平臺文庫構建簡介ctDNA簡介與液體活檢NGS應用及常見文庫種類常規(guī)文庫構建詳解目標區(qū)域捕獲技術介紹2015/8/282OutlineMandelandMetaisFrenchjournalDetectedfreeDNAandRNAHighlevelsofCNAinpatientsofpancreaticcancerplasmaDNAlevelsdecreasedafterchemotherapyImportanceofCNAwasrecognizedK-rasandN-rasgenemutationsintheplasmamyelodysplasticsyndromeHighconcentrationsoftumorDNAinplasma(orserum)withvariouscancersAgreatdealofinterestinthesubjectofCNAwiththepathologiesofcancerousandnon-cancerousorigin1940197719941999LastdecadectDNA簡介ctDNA也叫循環(huán)腫瘤DNA，指人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的攜帶一定特征（包括點突變，插入，缺失，重排，拷貝數(shù)變異）的來自腫瘤基因組的DNA片段ctDNA研究史2015/8/284ctDNA簡介ctDNA來源1、來自壞死的腫瘤細胞；2、來自凋亡的腫瘤細胞；3、循環(huán)腫瘤細胞；4、來自腫瘤細胞分泌的外排體ctDNA特征1、含量低：約占整個循環(huán)DNA的1%，甚至0.01%；2、高度片段化，呈現(xiàn)170bp的整數(shù)倍DNA分子纏繞在組蛋白上，形成核小體，每纏繞一圈剛好大約為170bp2015/8/285ctDNA的研究——Liquid

BiopsyctDNA的優(yōu)勢一類具備廣泛應用前景的腫瘤標志物，可無創(chuàng)的用于腫瘤早期診斷、發(fā)展過程監(jiān)測、預后判斷、以及個性化用藥指導無創(chuàng)、無損、實時、多次；當不能獲得腫瘤組織信息時，可以開展“液體活檢”；能夠對腫瘤的演化和適應性改變進行監(jiān)控；能夠對腫瘤病人的治療效果進行實時監(jiān)控，并進行個性化的治療方案指導2015/8/286cfDNA的分離血液的采集與運輸血清與血漿的分離促凝管自制抗凝管BCT管促凝劑或不添加添加EDTA或檸檬酸鈉

抗凝劑

分離血清專用短時間內分離血漿添加EDTA抗凝劑添加防腐劑穩(wěn)定有核細胞，防止基因組污染常溫保存可達14天16000g，10min高速離心，去除細胞碎片可用于提取cfDNA的血漿存于-80℃2015/8/287cfDNA的分離血漿cfDNA的提取過柱法與磁珠法QIAGENQIAampCirculatingNucleicAcidKit每次最多可以提取5ml血漿加入CarrierRNA作用：提高沉降系數(shù)；

防止硅膜產生靜電作用2015/8/288cfDNA提取后的檢測DNA拷貝數(shù)：一定質量的DNA中含有的該基因組一整套基因組的數(shù)量計算方式：NA*m/M例：求10ng人的DNA中基因組的拷貝數(shù)

1、首先計算人基因組的平均分子質量M=3*109堿基*660道爾頓/堿基

2、計算10ng人DNA的物質的量n=10*10-9g/M

3、拷貝數(shù)NA*n≈3000拷貝靈敏度再高的檢測手段都要結合實際！接近極限的檢測靈敏度十有八九是假！2015/8/289cfDNA提取后的檢測粗略檢測2100-H檢測插入片段大小由于提取中添加了Carrier

RNA，會影響Qubit的定量，為了更精準的要求，需要進行qPCR定量Qubit值約為qPCR定量值的2-2.5倍2015/8/2810cfDNA提取后的檢測大部分集中在10-15ng/ml提取量低的原因：1、血漿量不足2、凍融次數(shù)過多3、保存時間太長基因組污染的原因：1、BCT管收集血液方式不對；2、溶血3、未能去除細胞碎片達不到質控指標大于30ng無基因組污染2015/8/2811測序，二代測序測序就是分析特定DNA片段的堿基排列序列，也就是AGCT的排列方式二代測序Next

generation

sequencing，NGS，通過構建含有特定接頭序列的文庫來進行大規(guī)模的測序技術特點1、邊合成邊測序；2、讀長短，35bp-300bp3、通量高，Xten——1.8T數(shù)據量4、價格低，幾十億美元——萬元基因組應用基因組從頭測序（denovo）、重測序（re-sequencing）、基因組結構分析、轉錄組測序、表達譜分析、小RNA及非編碼RNA測序、表觀遺傳學研究2015/8/2812文庫種類文庫：目標DNA經過片段化之后添加測序接頭序列之后的小片段DNA的集合2015/8/2813常規(guī)文庫構建流程一、基因組DNA的片段化二、末端修復三、3’端腺苷化四、連接接頭五、PCR富集六、片段選擇、純化出庫2015/8/2814基因組DNA片段化根據測序策略的不同，將基因組DNA隨機打斷成一定大小的片段PE150:200-400bp；PE75:150-250bpLE220S220Covaris破碎法2015/8/2815基因組DNA片段化

A/B

C

D提取量大于100ng：A/B/C：正常建庫；D：風險建庫提取量小于100ng：A/B/C：正常建庫；D：放棄微量建庫DNA打斷方法：當起始量大于20ng小于100ng時，降解程度屬于A、B、C三個等級，為了保證DNA的最少損失，添加CarrierRNA進行輔助打斷。Covaris超聲隨機打斷2015/8/2816基因組DNA片段化轉座酶打斷Illumina：NexteraAgilent：SureSelectQXT快速：90分鐘即可完成文庫的制備微量：僅需1ngDNA起始量就可完成建庫局限：針對降解嚴重的樣本打斷情況不好2015/8/2817末端修復形成原因：打斷后形成3’或5’突出末端KlenowDNAPolymeraseT4

DNA聚合酶補平5'突出端，形成平末端切除3‘突出端，形成平末端T4

DNA聚合酶3’到5’的外切活性要高于Klenow聚合酶，但Klenow對模板高級結構的抵抗性能較好

T4PNKDNA5’末端的磷酸化，以便進行連接反應，除去3'磷酸基團2015/8/28183’端腺苷化簡單的酶促反應作用：在已修復的DNA3’端加上A，為下步TA連接接頭做準備Klenow（exo-）：是大腸桿菌DNA聚合酶I的蛋白水解產物。同大腸桿菌DNA聚合酶I一樣，具有5‘→3’的DNA聚合酶活性，但失去了5‘→3’外切核酸酶活性2015/8/2819連接接頭測序也是一個通過已知序列來測未知序列的過程，測序接頭就是其中的已知序列不同的測序儀具有不同的接頭序列，甚至同樣的測序儀也支持不同的接頭序列TP5’5’3’3’RD1

spRD2

spIndex

spIndex

P5P7IlluminaTruseq接頭結構Y字型；P5=59nt，P7=61nt；13bp互補配對；P5和P7端用于芯片雜交；RD1

sp，RD2

sp，Index

sp是測序引物結合位置，不同試劑盒會有所不同；3’端含有一個T堿基方便形成TA連接；Index用于區(qū)分不同文庫。2015/8/2820連接接頭T4連接酶，TA連接T4DNAligase是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5’-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵。快速連接酶

15min即可連接完成；

過夜連接與15min無區(qū)別Illumina建庫試劑盒連接接頭示意圖2015/8/2821連接接頭Agilent建庫試劑盒連接接頭示意圖NEB建庫試劑盒連接接頭示意圖特點：

接頭沒有P5/P7部分，沒有Index，

僅有RD1

sp和RD2

sp的一部分特點：環(huán)狀接頭，含有一個U堿基

接頭沒有P5/P7部分，沒有Index，

僅有RD1

sp和RD2

sp的一部分2015/8/2822PCR擴增引物：P5、P7循環(huán)數(shù)：5-8cycles擴增產物使用1.8倍體積AMPuerXPbeads純化，去除小片段以及接頭如果采用Agilent或者NEB的建庫策略，不能使用P5、P7引物，需要使用特定序列的對應引物進行擴增2015/8/2823片段選擇，純化出庫膠回收進行片段選擇及純化1、去除未連接的接頭及接頭自連體；2、篩選合適的size大小進行上機測序500bp250bp出庫文庫，接頭120bp打斷后，PE752015/8/2824目標區(qū)域捕獲目標區(qū)域捕獲利用序列捕獲技術將目標區(qū)域的DNA捕捉并富集，結合高通量測序平臺進行測序的研究策略。優(yōu)勢:研究區(qū)域集中，大大降低測序費用，周期和工作量；適用于高深度測序，發(fā)現(xiàn)低頻突變。

2015/8/2825液相捕獲技術介紹常用的液相雜交捕獲試劑主要有Agilent，Roche和Illumina優(yōu)點缺點Agilent1、周期短2、捕獲效率高3、相同測序深度，數(shù)據量少1、操作要求高2、成本高3、探針不穩(wěn)定4、探針的覆蓋區(qū)域小5、不能多個樣品混合雜交Truseq1、成本低2、探針穩(wěn)定3、探針的覆蓋區(qū)域大4、可以混合多個樣品雜交1、實驗流程繁瑣，周期長2、捕獲效率低3、相同測序深度，數(shù)據量多NimbleGen1、成本較低2、探針穩(wěn)定3、覆蓋區(qū)域大4、可以混合雜交1、雜交時間長2、捕獲效率較低2015/8/2826Agilent捕獲簡要流程Pre-capturelibraryBlockingoligos雜交緩沖液生物素標記的探針（RNA，120nt）95℃變性解鏈，65℃退火復性16-24h捕獲與洗脫鏈霉親和素磁珠與含有生物素的探針結合，高溫條件下進行洗脫，去除非特異性片段PCR富集，添加Index；10-12cycles2015/8/2827文庫的封閉DNA

insertP5

adapterP7

adapterIndexP5

blockP7

blockIndex

block（1-96）Cot-1

DNA95℃變性解鏈高度重復區(qū)域2015/8/2828120nt

RNA

probe文庫的雜交由于探針是RNA探針，在對文庫進行封閉之后，加入探針之前，首先要加入RNAase

block來阻斷RNA酶的功能，防止RNA降解全部就緒之后，加入雜交緩沖液和RNA探針，進行雜交SureSelectXT需要16-24h；SureSelectQXT需要2個小時Biotin2015/8/2829捕獲與洗脫2015/8/2830常見的鏈霉親和素磁珠2015/8/2831混合雜交捕獲節(jié)約探針的成本——每個800元左右；預擴增失敗的樣本，達不到雜交最低要求目的：盡可能混合均勻，不影響產出方法：根據插入片段大小分布及摩爾數(shù)進行等比例混合對于接頭和大于1Kb的片段，qPCR是可以定量出來的，但是雜交時候不能計算在內，需要通過2100計算200-1000bp的片段的有效濃度。