臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)公開課一等獎?wù)n件省賽課獲獎?wù)n件

臨床微生物學(xué)檢查技術(shù)第1頁一、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查不染色標(biāo)本檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌動力及運(yùn)動情況壓滴法和懸滴法病原菌初步判定：霍亂弧菌制動試驗(yàn)染色標(biāo)本革蘭染色抗酸染色熒光染色鞭毛染色莢膜染色特殊染色：異染顆粒、芽胞染色、墨汁染色第2頁一、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查（一）制片

1.涂片取潔凈載玻片一張，用標(biāo)識筆一分為二，用接種環(huán)取生理鹽水2環(huán)，分別置于玻片兩端，接種環(huán)滅菌后，取金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物少許與鹽水混勻，并涂成均勻薄膜涂片。接種環(huán)滅菌后以同樣辦法再取大腸埃希菌少許，與另一端生理鹽水混勻后涂成均勻薄膜。如用液體材料，如痰、尿液、膿汁等可直接涂片，無須加生理鹽水。

第3頁2.干燥涂片最佳在室溫下自然干燥，必要時可將標(biāo)本面向上，小心間斷地在弱火高處烘干，但切勿緊靠火焰將涂膜烤枯。

3.固定涂片干燥后，將標(biāo)本片在酒精燈上迅速來回通過三次，共約2s～3s，注意溫度不可太高，以涂片涂膜背面觸及皮膚覺輕微燙覺即可。固定目標(biāo)：①殺死細(xì)菌；②使菌體與玻片粘附較牢，在染色時不致被染液和水沖掉；③菌體蛋白變性易著色。第4頁涂片干燥固定染色鏡檢第5頁（二）革蘭染色法1.原理

（1）革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁構(gòu)造較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易滲入；革蘭陰性菌細(xì)胞壁構(gòu)造較疏松，肽聚糖層少，脂質(zhì)含量多，乙醇易滲入。

（2）革蘭陽性菌等電點(diǎn)低，革蘭陰性菌等電點(diǎn)較高，在相同pH條件下，革蘭陽性菌所帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌多，與帶正電荷結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢靠不易脫色。

（3）革蘭陽性菌細(xì)胞內(nèi)具有大量核糖核酸鎂鹽，可與結(jié)晶紫和碘牢靠結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被乙醇脫色；而革蘭陰性菌細(xì)胞內(nèi)含很少許核糖核酸鎂鹽，吸附染料量少，形成復(fù)合物分子也較小，故易被乙醇脫色。第6頁2.染色辦法（1）標(biāo)本涂片、干燥和固定。

（2）染色：在已固定細(xì)菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，室溫作用1min，用細(xì)流水輕輕沖洗，甩去積水。再滴加碘液數(shù)滴，室溫作用1min，沖洗。滴加95%酒精數(shù)滴，輕輕搖動玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，使脫掉染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下酒精無色為止（約需30s），立即用細(xì)流水將酒精沖掉。再滴加稀釋石炭酸復(fù)紅液復(fù)染約30s后用細(xì)流水沖洗。

（3）標(biāo)本染色后，晾干或用吸水紙吸干，滴香柏油后用油鏡觀測。

第7頁第8頁3.成果紫色為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌。第9頁（二）抗酸染色1.原理分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多，其中主要成份為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢靠，能抵抗酸性乙醇脫色作用，因此抗酸菌能保持復(fù)紅顏色，達(dá)成染色目標(biāo)。第10頁2.辦法（1）萋納石炭酸復(fù)紅染色，加溫促使菌體著色5min；（2）流水沖洗，3%鹽酸酒精脫色1~3min；（3）呂氏美藍(lán)復(fù)染30s。第11頁第12頁3.成果未脫色細(xì)菌呈紅色為抗酸性細(xì)菌,脫色經(jīng)復(fù)染呈藍(lán)色細(xì)菌為非抗酸性細(xì)菌。第13頁（三）鞭毛染色1.原理細(xì)菌鞭毛能被堿性復(fù)紅酒精飽和溶液著色，是由于在染色過程中伴隨酒精蒸發(fā)其染料沉積在鞭毛上，使鞭毛著色。堿性復(fù)紅作為主要染料，而丹寧酸為媒染劑。第14頁2.辦法（1）采取點(diǎn)種法接種變形桿菌（或其他鞭毛菌），近離接種點(diǎn)菌，鞭毛細(xì)，菌體較短；遠(yuǎn)離接種點(diǎn)菌，鞭毛粗，菌體長，用無菌接種環(huán)取遠(yuǎn)離接種點(diǎn)菌混懸于盛有沒有菌蒸溜水平皿內(nèi)，不要研磨以免鞭毛脫落，置室溫放置10～15min，使鞭毛膨大。

（2）用毛細(xì)滴管將菌液滴于潔凈玻片上，遲緩傾斜玻片任菌液流開，始之成為均勻薄膜，將玻片置37℃溫箱內(nèi)，任其自然干燥，切勿用火焰固定。

（3）在干燥標(biāo)本片上滴加鞭毛染色液1～2滴，使覆蓋于薄膜上，作用1～2min后輕輕用水沖，干后鏡檢觀測。第15頁3.成果菌體染成紅色（或深紫色），鞭毛染成淡紅色（或淡紫色），染色時間越長，鞭毛越粗。第16頁（四）莢膜染色1.原理莢膜為細(xì)菌細(xì)胞壁外圍黏液層，對染料親和力很低，用一般染色不易著色，必須通過莢膜染色辦法或襯托染色，方能清楚識別出莢膜。2.辦法用有莢膜細(xì)菌培養(yǎng)物涂片，火焰固定，固定標(biāo)本后加1%結(jié)晶紫染液，室溫保持1min后，倒去染液，然后用20%硫酸銅水溶液沖洗染液，勿水洗。待干后鏡檢觀測。第17頁3.成果菌體為深紫色，莢膜為無色或淡紫色。第18頁（四）墨汁染色1.原理

2.辦法

第19頁3.成果菌體為深紫色，莢膜為無色或淡紫色。第20頁（一）培養(yǎng)基分類成份用途形態(tài)

血平板巧克力血平板第21頁伊紅美藍(lán)平板

麥康凱平板

SS平板M-H平板第22頁培養(yǎng)基選擇根據(jù)標(biāo)本起源和也許存在病原菌血平板巧克力血平板中國藍(lán)平板或伊紅亞甲藍(lán)平板麥康凱平板SS瓊脂堿性瓊脂或TCBS瓊脂血液增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯第23頁分離培養(yǎng)細(xì)菌分離平板劃線分離法斜面接種法液體接種法穿刺接種法傾注培養(yǎng)法涂布接種法第24頁二、分離培養(yǎng)（一）劃線接種1.辦法斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法。斜線法第25頁曲線法方格法第26頁放射法四格法第27頁第28頁分離培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)辦法需氧培養(yǎng)法二氧化碳培養(yǎng)法厭氧培養(yǎng)法第29頁三、生化反應(yīng)酶系統(tǒng)對底物分解能力代謝產(chǎn)物掌握多種生化反應(yīng)原理和應(yīng)用是細(xì)菌判定基礎(chǔ)第30頁三、生化反應(yīng)（一）碳水化合物代謝試驗(yàn)

1.糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)

原理：不一樣種類細(xì)菌具有發(fā)酵不一樣糖（醇、苷）類酶，因而對多種糖（醇、苷）類代謝能力也有所不一樣，雖然能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細(xì)菌對培養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣能力，可用以判定細(xì)菌種類。

辦法：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（如酚紅肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）特定糖（醇、苷）類。所使用糖（醇、苷）類有很多種。將待判定純培養(yǎng)細(xì)菌接種入試驗(yàn)培養(yǎng)基中，置35℃孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時后，觀測成果;若用微量發(fā)酵管，或要求培養(yǎng)時間較長時。第31頁

成果：能分解糖（醇、苷）產(chǎn)酸細(xì)菌，培養(yǎng)基中批示劑呈酸性反應(yīng)（如酚紅變?yōu)辄S色），產(chǎn)氣細(xì)菌可在小倒管（Durham小管）中產(chǎn)氣憤泡，固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂隙。不分解糖則無變化。

應(yīng)用：是判定細(xì)菌最主要和最基本試驗(yàn)，尤其對腸桿菌科細(xì)菌判定尤為主要。第32頁2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗(yàn)(O-F試驗(yàn)）

原理：細(xì)菌在分解葡萄糖過程中，必須有分子氧參與，稱為氧化型；能進(jìn)行無氧降解為發(fā)酵型；不分解葡萄糖細(xì)菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細(xì)菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，而氧化型細(xì)菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。本試驗(yàn)又稱氧化發(fā)酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）試驗(yàn)，可用于區(qū)分細(xì)菌代謝類型。

辦法：挑取少許純培養(yǎng)物（不要從選擇性平板中挑?。┙臃N1支HL培養(yǎng)管中，從培養(yǎng)基表面穿刺到其底部。置35℃孵箱孵育48h以上。第33頁

成果：培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；培養(yǎng)基表面和底部都產(chǎn)酸（變黃）為發(fā)酵型；培養(yǎng)基表面變?yōu)樯钏{(lán)色為產(chǎn)堿型；培養(yǎng)基表面變黃、底部不色變?yōu)檠趸汀?為產(chǎn)堿型2為氧化型3為發(fā)酵型

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與其他非發(fā)酵菌鑒別。腸桿菌科、弧菌科細(xì)菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化型）。第34頁3．甲基紅（MR）試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸深入被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)基pH下降至4.5下列時，加入甲基紅批示劑呈紅色。如細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生酸深入轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)（如醇、醛、酮、氣體和水），培養(yǎng)基pH在5.4以上，加入甲基紅批示劑呈桔黃色。

辦法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48~96h后，于5ml培養(yǎng)基中滴加5~6滴甲基紅批示劑，立即觀測成果。第35頁

成果判定：展現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽性。

應(yīng)用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬鑒別，如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性。第36頁4．Β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)）

原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能迅速分解。有些細(xì)菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖迅速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵細(xì)菌均可迅速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黃色鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬鑒別。

辦法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，觀測成果。第37頁成果：展現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。第38頁

應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌迅速判定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖細(xì)菌均可短時間內(nèi)展現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗(yàn)陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。第39頁5．VP試驗(yàn)

原理：測定細(xì)菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇能力。某些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸深入脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進(jìn)而與培養(yǎng)基中精氨酸等含胍基物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物。即V-P試驗(yàn)陽性。

辦法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，輕輕振搖試管，然后加0.2ml400g/LKOH，輕輕振搖試管30s至1min，然后靜置觀測成果。第40頁

成果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性第41頁

應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌鑒別。本試驗(yàn)常與MR試驗(yàn)一起使用，一般情況下，前者為陽性細(xì)菌，后者常為陰性，反之亦然。第42頁6．膽汁七葉苷水解試驗(yàn)

原理：在10%~40％膽汁存在下，測定細(xì)菌水解七葉苷能力。七葉苷被細(xì)菌分解生成七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中枸櫞酸鐵二價鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。

辦法：將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h后，觀測成果。

成果：培養(yǎng)基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。

應(yīng)用：主要用于鑒別腸球菌與其他鏈球菌區(qū)分，以及腸桿菌科某些種、某些厭氧菌（如脆弱擬桿菌等）初步鑒別。腸球菌本試驗(yàn)為陽性。第43頁（二）細(xì)菌對于蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗(yàn)

1.明膠液化試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生一種胞外酶-明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體明膠培養(yǎng)基成為流動液體。辦法：將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于22℃培養(yǎng)7d，逐日觀測成果。若用35℃孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在觀測成果前，先置4℃冰箱內(nèi)30min，再看成果。第44頁

成果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌鑒別，如沙雷菌、一般變形桿菌、奇異變形桿菌、陰溝桿菌等可液化明膠，而其他細(xì)菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。第45頁陰性陽性第46頁2.吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），當(dāng)加入吲哚試劑（對二甲氨基苯甲醛）后則形成紅色玫瑰吲哚。培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。辦法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)24～48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑。成果：于二者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌判定。第47頁第48頁3.硫化氫試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛或亞鐵離子則形成黑褐色硫化鉛或硫化鐵沉淀。此試驗(yàn)可間接檢測細(xì)菌是否產(chǎn)生硫化氫。培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。辦法：將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)24～48h觀測成果。第49頁

成果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種鑒別。如沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬細(xì)菌，絕大多數(shù)硫化氫陽性，其他菌屬陰性。沙門菌屬中也有硫化氫陰性菌種。第50頁第51頁4.尿素分解試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量氨，使培養(yǎng)基呈堿性。培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。辦法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)18～24h觀測成果。成果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅批示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮?。?yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌判定。奇異變形桿菌和一般變形桿菌脲酶陽性。另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。第52頁陽性陰性陰性第53頁5.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。辦法：將被檢菌濃厚接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于35℃培養(yǎng)18～24h，滴加10％三氯化鐵試劑3～4滴，自斜面上方流下。第54頁

成果：出現(xiàn)綠色為陽性。應(yīng)立即觀測成果，延長反應(yīng)時問會引發(fā)褪色。加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色為陽性第55頁

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌判定。變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和摩根菌屬細(xì)菌均為陽性，腸桿菌種中其他細(xì)菌均為陰性。第56頁6.氨基酸脫羧酶試驗(yàn)

原理：具有氨基酸脫羧酶細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿。使批示劑顯示出來。培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基。辦法：將被檢菌分別接種于賴氨酸（或鳥氨酸或精氨酸）培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基中，并加入無菌液體石蠟或礦物油，于35℃培養(yǎng)1～4d，每日觀測成果。第57頁

成果：孵育后，對照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色（批示劑為溴甲酚紫）為陽性；若測定管呈黃色為陰性。若對照管展現(xiàn)紫色則試驗(yàn)無意義，重新做試驗(yàn)。氨基酸對照鳥氨酸賴氨酸鳥氨酸為陽性賴氨酸為陰性氨基酸對照第58頁

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌判定。如沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其他沙門菌賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。第59頁（三）碳源和氮源利用試驗(yàn)

1.枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌能以銨鹽為唯一氮源，并且利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿性。培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基。辦法：將被檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)1～4d，每日觀測成果。第60頁

成果：培養(yǎng)基中溴麝香草酚蘭批示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性；不能利用枸櫞酸鹽作為碳源細(xì)菌，在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基則不變色，為陰性。第61頁

應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間判定。在腸桿菌科中埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬一般為陽性。第62頁2.丙二酸鹽試驗(yàn)原理：丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細(xì)菌判定中一種鑒別性特性。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)一種步驟，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，因此琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基接種：用幼齡菌種接種測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng)1～2d，觀測培養(yǎng)基變色情況。觀測成果：如測定培養(yǎng)基生長并變藍(lán)色，表達(dá)可利用丙二酸鹽，為陽性成果；如測定培養(yǎng)基未變色，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。第63頁2.丙二酸鹽利用試驗(yàn)

（1）原理：有細(xì)菌可利用丙二酸鹽作為唯一碳源，將丙二酸鹽分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。（2）培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基。（3）辦法：將被檢菌接種于上述培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24～48h后觀測成果。（4）成果：培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，顏色無變化為陰性。（5）應(yīng)用：腸桿菌科中屬間及種鑒別?？死撞鷮贋殛栃?，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬中有些菌種也呈陽性，其他菌屬均為陰性。第64頁（四）氧化酶試驗(yàn)

原理：氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)最后呼吸酶。具有氧化酶細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色醌類化合物。試劑：1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二胺。辦法：

1.菌落法直接滴加試劑于被檢菌菌落上。

2.濾紙法取潔凈濾紙一小塊，沾取菌少許，然后加試劑。

3.試劑紙片法將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。第65頁

成果：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈（二甲基對苯二胺鹽酸鹽為紫紅色，四甲基對苯二胺鹽酸鹽為藍(lán)色）為陽性。分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌鑒別，前者為陰性，后者為陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細(xì)菌也呈陽性反應(yīng)。第66頁（五）觸酶試驗(yàn)原理：具有過氧化氫酶細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成份子氧出現(xiàn)氣泡。試劑：3%過氧化氫溶液。辦法：取菌落置于潔凈試管內(nèi)或玻片上，然后加3%過氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3%過氧化氫于不含血液細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀測成果。成果：有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性。不產(chǎn)氣憤泡者為陰性。應(yīng)用：革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗(yàn)常用于革蘭陽性球菌初步分群。第67頁第68頁（六）硝酸鹽還原試驗(yàn)原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個過程：一是在合成過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其他含氮化合物；二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽替代氧作為呼吸酶系統(tǒng)中終末受氫體。能使硝酸鹽還原細(xì)菌從硝酸鹽中取得氧而形成亞硝酸鹽和其他還原性產(chǎn)物。但硝酸鹽還原過程因細(xì)菌不一樣而異，有細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌；有細(xì)菌則可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)銨；有細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如假單胞菌等。硝酸鹽還原試驗(yàn)系測定還原過程中所產(chǎn)生亞硝酸。培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基。試劑：甲液（對氨基苯磺酸0.8g+5mol／L醋酸100ml；乙液（α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸100ml）。辦法：被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)1～4d，將甲、乙液等量混合后（約0.1ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀測成果。第69頁

成果：出現(xiàn)紅色為陽性。若加入試劑后無顏色反應(yīng)，也許是：

1.硝酸鹽沒有被還原，試驗(yàn)陰性；

2.硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而造成假陰性成果，這時應(yīng)在試管內(nèi)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表白試驗(yàn)確實(shí)為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表達(dá)試驗(yàn)為假陰性。若要檢查是否有氮?dú)猱a(chǎn)生，可在培養(yǎng)基管內(nèi)加一小倒管，如有氣泡產(chǎn)生，表達(dá)有氮?dú)馍舍t(yī)`學(xué)教育網(wǎng)搜集整頓。應(yīng)用：本試驗(yàn)在細(xì)菌判定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮?dú)?；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗(yàn)也為陽性。第70頁第71頁（七）DNA酶試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌產(chǎn)生DNA酶，可使長鏈DNA水解成寡核苷酸鏈。由于長鏈DNA可被酸沉淀，寡核苷酸鏈則溶于酸，因此當(dāng)菌落平板上加入酸后，會在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。培養(yǎng)基：0.2％DNA瓊脂平板。辦法：將被檢菌點(diǎn)種于上述平板上，于35℃培養(yǎng)18～24h，用lm