火炬松的組織培養(yǎng)再生體系的建立

火炬松的組織培養(yǎng)再生體系的建立

火炬松是世界上首次分布、生長(zhǎng)面積最大、木材年產(chǎn)量最高、蓄積量最大的綠化和造林樹種，也是一種廣泛引入中國的。然而，大面積的松樹、棕色樹木的流行量制約了中國南方的發(fā)展。通過抗病選育的方式選出了一批優(yōu)良的火炬松抗病家系,但種子產(chǎn)量有限,難以滿足生產(chǎn)需要。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是快速繁殖木本植物,尤其是繁殖優(yōu)良樹種的理想途徑,開展火炬松組織培養(yǎng)技術(shù)研究對(duì)于加快抗病良種的推廣無疑有著重要的意義。自從1974年Sommer目前可通過成熟胚1材料和方法1.1無菌苗的培養(yǎng)試驗(yàn)使用的火炬松成熟種子由國家林業(yè)局南方林木種子檢驗(yàn)中心提供,使用前經(jīng)4℃低溫河沙層積處理40d。將層積處理過的火炬松種子取出,用0.1%高錳酸鉀預(yù)消毒處理12h,流水沖洗1h,沖洗完畢后,在無菌條件下剝除種殼后用紗布包好,經(jīng)70%乙醇表面消毒30s后置于0.1%升汞浸泡2～3min,用無菌水沖洗4～5次后,用滅菌濾紙吸干其表面水分,移入PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)成無菌苗。1.2培養(yǎng)基的制備切取培養(yǎng)20d左右的火炬松實(shí)生無菌苗帶子葉頂芽,接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良GD附加6-BA(1、2、3、4mg/L)及NAA(0.02、0.05mg/L)按兩因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)進(jìn)行激素組合試驗(yàn)。4周后觀察外植體生長(zhǎng)狀況并統(tǒng)計(jì)有叢生芽分化的外植體數(shù),計(jì)算誘導(dǎo)率(有芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù))。選取有叢生芽分化的外植體轉(zhuǎn)移至添加生長(zhǎng)素NAA(0.02、0.05、0.1mg/L)或活性炭AC(0.2、0.5、1.0g/L)的改良GD培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長(zhǎng)試驗(yàn)。當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至1.0～1.5cm,將其單個(gè)切下,接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行不定根誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)基為1/2改良GD添加不同濃度的NAA(0.02、0.05、0.1、0.5mg/L)。以上培養(yǎng)基除生根培養(yǎng)基中蔗糖濃度為20g/L外,其余均添加蔗糖30g/L、水解酪蛋白(CH)500mg/L、谷氨酰胺(Gln)450mg/L、瓊脂6g/L,pH5.8±0.01,121℃高溫、0.105MPa高壓滅菌18min。全部培養(yǎng)過程均在MDF-UTN光照培養(yǎng)箱中完成,溫度24±1℃,光照強(qiáng)度2000lx,每日光照16h。2結(jié)果與分析2.1叢生芽誘導(dǎo)率火炬松帶子葉頂芽接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中3～4周后,在附加6-BA1～2mg/L的培養(yǎng)基中外植體頂芽伸長(zhǎng)較快,少數(shù)外植體子葉基部有芽出現(xiàn);附加6-BA3～4mg/L的培養(yǎng)基中的外植體頂芽微微膨大,大多數(shù)外植體子葉基部出現(xiàn)叢生芽。表1結(jié)果顯示,叢生芽誘導(dǎo)率隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度升高梯度上升,說明誘導(dǎo)率與6-BA濃度之間存在一定的相關(guān)性,適宜的培養(yǎng)基組合為GD+6-BA4.0mg/L+NAA0.02mg/L,在該組合中叢生芽誘導(dǎo)率較高達(dá)86.7%,每個(gè)外植體平均分化芽6～8個(gè),芽長(zhǎng)4～5mm(圖1A)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),獲取外植體的無菌苗苗齡對(duì)火炬松叢生芽誘導(dǎo)有很大影響:以14～21d苗齡的無菌苗為外植體能誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的叢生芽,且無玻璃化現(xiàn)象;幼嫩的無菌苗(14d以下)接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上一段時(shí)間后,葉片皺縮或反卷,整個(gè)外植體呈半透明腫脹狀,玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重,誘導(dǎo)出的叢生芽最終長(zhǎng)成無用的玻璃化枝。2.2火炬松叢生芽的生長(zhǎng)2.2.1叢生芽伸長(zhǎng)和葉的變化在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后,將帶有叢生芽的外植體轉(zhuǎn)入添加生長(zhǎng)素的改良GD培養(yǎng)基中。結(jié)果表明,低濃度的生長(zhǎng)素(NAA)對(duì)叢生芽的伸長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,在含有生長(zhǎng)素NAA0.02、0.05mg/L的改良GD培養(yǎng)基對(duì)叢生芽的伸長(zhǎng)明顯,5周后大部分叢生芽能長(zhǎng)至1.0～1.5cm,但針葉有些老化(圖1B)。NAA濃度超過0.1mg/L時(shí),在外植體切口處易產(chǎn)生愈傷組織。愈傷組織褐變后往往會(huì)分泌有毒物質(zhì)從而對(duì)外植體及叢生芽產(chǎn)生毒害。2.2.2g/l的gs培養(yǎng)基在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后,將帶有叢生芽的外植體轉(zhuǎn)入添加活性炭(0.2～1.0g/L)的GD培養(yǎng)基中。5周后統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,活性炭對(duì)火炬松叢生芽的伸長(zhǎng)具有非常明顯的促進(jìn)作用,在添加0.5～1.0g/L活性炭的培養(yǎng)基中叢生芽生長(zhǎng)旺盛,長(zhǎng)1.0～2.0cm(圖1C)。2.2.3誘導(dǎo)培養(yǎng)的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的6-BA濃度對(duì)叢生芽的繼代伸長(zhǎng)有一定的影響。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的6-BA濃度低,誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽數(shù)量較少,在伸長(zhǎng)培養(yǎng)階段伸長(zhǎng)較快且比較茁壯。相反,誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的6-BA濃度高,誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽數(shù)量較多,但其伸長(zhǎng)相對(duì)要慢,且比較細(xì)。因此,誘導(dǎo)叢生芽并非越多越好,一般以5～8個(gè)為宜,這樣的芽簇結(jié)構(gòu)比較松散,莖容易伸長(zhǎng),也便于以后切割。2.3外植體切口愈傷組織的分離單個(gè)叢生芽接種到生根培養(yǎng)基上3周后,在附加不同濃度NAA的培養(yǎng)基上大部分外植體切口處產(chǎn)生潔白的愈傷組織,但都沒有不定根的分化。1個(gè)月后,在添加NAA0.02、0.05、0.1mg/L的培養(yǎng)基中分別有少數(shù)芽長(zhǎng)出潔白的不定根,但生根率最高只有12.5%(表2,圖1D)。3火炬松木木芽的誘導(dǎo)效果本試驗(yàn)以火炬松帶子葉頂芽為外植體,初步建立了組織培養(yǎng)植株再生體系。研究結(jié)果表明,誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的6-BA濃度對(duì)叢生芽誘導(dǎo)率及每外植體所形成的叢生芽數(shù)有較