動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定

動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第1頁核酸是一類生物高分子化合物，存在于一切生物體內(nèi)，是組成細(xì)胞主要成份。它以與蛋白質(zhì)結(jié)合形式——核蛋白存在于細(xì)胞中，是生命基礎(chǔ)物質(zhì)之一，含有儲(chǔ)存、復(fù)制生物體遺傳信息功效，也是蛋白質(zhì)合成不可缺乏物質(zhì)，所以它對于生物體生長、遺傳、變異等現(xiàn)象起著主要決定作用。核酸分為兩大類——核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷酸混合物。核酸個(gè)別水解則產(chǎn)生核苷和核苷酸。每個(gè)核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸個(gè)別水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離判定。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第2頁DNA和RNA結(jié)構(gòu)動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第3頁組成核酸戊糖有兩種。DNA所含糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含糖則為β-D-核糖。RiboseDeoxyribose動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第4頁1.豬肝DNA和RNA分離

核酸分離標(biāo)準(zhǔn)

核酸存在于各種細(xì)胞，所以分離方法復(fù)雜而多樣。又因各種DNA、RNA含量差異，各種分析方法對核酸純度及量要求有差異，所以在試驗(yàn)前應(yīng)對所采取方法有所了解和選擇?？傉f來核酸分離與純化是在溶解細(xì)胞基礎(chǔ)上，利用苯酚等有機(jī)溶劑抽提（核酸溶于緩沖液，即水相），分離，純化；利用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑沉淀，收獲。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第5頁核酸分離普通步驟

1.溶解細(xì)胞溶解細(xì)胞方法因樣品不一樣而不一樣。有是用十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS）加NaOH，有是用蛋白酶，有用超聲波破碎等方法。2．有機(jī)溶劑抽提利用苯酚提取主要使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機(jī)相，而核酸保留在水相，到達(dá)分離核酸目標(biāo)。實(shí)際上生物樣品中含量最多就是蛋白質(zhì)。3.純化為了得到純核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA，得到純DNA；用DNA酶除去DNA，得到純RNA。4.沉淀為了除去分離過程中殘留有機(jī)溶劑，常見方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，再經(jīng)過離心回收核酸，然后用80%乙醇洗滌沉淀，除去多出鹽，以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟酶促反應(yīng)。當(dāng)前開發(fā)了許多商品化核酸分離柱，試劑盒,可簡單、快速地分離得到純度很高DNA或RNA，其分離原理有是利用核酸分子量差異，有是利用所需分離核酸特點(diǎn)將其特異性結(jié)合到達(dá)分離、回收目標(biāo)。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第6頁DNA和RNA分離基礎(chǔ)原理依據(jù)核糖核蛋白與脫氧核糖核蛋白在一定濃度氯化鈉溶液中溶解度不一樣進(jìn)行分離，然后用蛋白質(zhì)變性沉淀劑去除蛋白，使核酸釋放出來，再利用核酸不溶于乙醇性質(zhì)將核酸析出，到達(dá)分離DNA和RNA目標(biāo)。在0.14mol/L氯化鈉溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度??；相反在1mol/L氯化鈉溶液中，DNA核蛋白溶解度大，而RNA核蛋白溶解度小，從而使DNA和RNA核蛋白分開。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第7頁酚：氯仿：異戊醇抽提酚：有效使蛋白質(zhì)變性，不能完全抑制RNA酶活性，能溶解帶有長poly(A)RNA分子。使用前必須用水飽和并用Tris平衡至pH>7.8，以預(yù)防DNA分配到有機(jī)相。結(jié)晶酚要在182度下重蒸去除醌類等氧化產(chǎn)物，這些物質(zhì)能夠引發(fā)磷酸二酯鍵斷裂或促進(jìn)核酸交聯(lián)。純酚比重為1.07，有機(jī)相和水相有時(shí)極難分開。氯仿：純酚比重為1.07，有機(jī)相和水相有時(shí)極難分開。加入氯仿（比重為1.47）能夠防止這一問題。同時(shí)，酚有時(shí)會(huì)微溶于水。能夠用氯仿將水相中酚去除。異戊醇：降低泡沫產(chǎn)生。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第8頁試驗(yàn)步驟動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第9頁2.核糖和脫氧核糖顯色試驗(yàn)加熱條件下：D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚綠色D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺藍(lán)紫色動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第10頁DNA：1mlSC溶液溶解DNA，然后轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，用9ml0.01MNaOH溶液溶解，4000rpm離心10分鐘，上清轉(zhuǎn)移到試管中備用。各取上述1mlDNA溶液于兩個(gè)試管中，其中一個(gè)里面加入3ml地衣酚試劑，然后在沸水中20min，觀察顏色反應(yīng)；另外一只試管中加入2ml二苯胺試劑，60℃條件下反應(yīng)1h，觀察顏色反應(yīng)。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第11頁RNA：將RNA沉淀用2ml蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)移至2只試管中，每只1ml。其中一只試管中加入3ml地衣酚試劑，然后在沸水中20min，觀察顏色反應(yīng)；另外一只試管中加入2ml二苯胺試劑，60℃條件下反應(yīng)1h，觀察顏色反應(yīng)。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第12頁3.核酸定量和純度測定紫外分光光度法（此法要求核酸純度很高，1個(gè)Abs相當(dāng)于50ug/ml雙螺旋DNA,除了定量測定以外還可進(jìn)行核酸純度檢測，A260/A280比值，純DNA為1.8，RNA為2.0，樣品中含有蛋白質(zhì)和苯酚時(shí)，A260/A280

比值降低。）定糖法（DNA糖個(gè)別為脫氧核糖，RNA糖個(gè)別為核糖，分別能夠進(jìn)行二苯胺顯色法和地衣酚顯色法）定磷法（核酸磷酸個(gè)別）動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第13頁二苯胺顯色法原理DNA在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，而2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊糖，與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，在595nm波優(yōu)點(diǎn)有最大吸收。DNA在40~400μg范圍內(nèi)，光吸收與DNA濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少許乙醛，能夠提升反應(yīng)靈敏度。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第14頁試驗(yàn)方法A260測定:以H2O作為空白，取上清測A260值后確定稀釋倍數(shù)，使A260值在2.0左右（DNA此時(shí)濃度約為100ug/ml。（因?yàn)槎桨贩y定范圍是40-400ug/mlDNA，所以DNA濃度假如太小會(huì)影響測定結(jié)果）A280測定：A260/A280比值計(jì)算。純DNA為1.8，RNA為2.0。假如樣品中混有RNA，則比值大于1.8；假如樣品中混有蛋白質(zhì)，則比值小于1.8。所用DNA溶液為前面提取后溶解DNA樣品。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第15頁DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和樣品測定試劑管號(hào)0對照12345樣品1樣品2DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液,ml0.00.40.81.21.62.02.02.0蒸餾水，ml2.01.61.20.80.4000二苯胺試劑,ml4.04.04.04.04.04.04.04.0OD595注：待測溶液中DNA含量應(yīng)調(diào)整至標(biāo)準(zhǔn)曲線可讀范圍內(nèi)。樣品1和樣品2為不一樣稀釋倍數(shù)DNA溶液。按上表加完各試劑后，充分混勻。于60℃水浴中保溫1h，冷卻后于595nm波優(yōu)點(diǎn)以0管為空白調(diào)零，測定各管光密度（OD595nm）。以DNA含量為橫坐標(biāo)，光密度（吸收值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。動(dòng)物組織核酸的分離鑒定和含量測定第16頁DNA含量計(jì)算DNA含量計(jì)算：以樣品光密度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相對應(yīng)DNA含量。并