飼料中添加殼寡糖對(duì)克氏原螯蝦消化酶活性、腸道菌群結(jié)構(gòu)及血清非特異性免疫指標(biāo)的影響

飼料中添加殼寡糖對(duì)克氏原螯蝦消化酶活性、腸道菌群結(jié)構(gòu)及血清非特異性免疫指標(biāo)的影響

克里斯科倫、美沙頓和元錨蝦通常被稱為淡啤酒和小龍蝦。在動(dòng)物學(xué)上，它屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、甲殼素科、元葉蝦科和上升蝦科。它來(lái)自美國(guó)和墨西哥，在20世紀(jì)30年代從日本傳入中國(guó)。殼寡糖（chitosanoligosaccharide,COS）是通過(guò)甲殼素脫乙酰化的產(chǎn)物殼聚糖（chitosan）降解得到的由2～10個(gè)氨基葡萄糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成的低聚糖。殼寡糖具有多種生理功能，應(yīng)用比較廣泛，具有提高養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)性能、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、改善腸道組織形態(tài)、影響血液生化指標(biāo)和增強(qiáng)免疫能力等功能1材料和方法1.1基礎(chǔ)飼料的配方及原料殼寡糖購(gòu)于濟(jì)南某生物工程有限公司，為黃色粉末狀，相對(duì)分子質(zhì)量為3000，脫乙酰基含量≥85%，水分含量≤10%，粗灰分含量≤1%?；A(chǔ)飼料為商品料，顆粒狀，購(gòu)于某生物科技有限公司，主要原料包括大豆粕、魚(yú)粉、菜籽粕、高筋面粉、玉米蛋白粉、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)元素及其絡(luò)合物等。經(jīng)二硝基水楊酸（DNS）法1.2試驗(yàn)分組與飼養(yǎng)試驗(yàn)蝦購(gòu)于梁子湖克氏原螯蝦養(yǎng)殖基地，試驗(yàn)開(kāi)始前暫養(yǎng)7d，期間投喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)開(kāi)始前禁食24h。養(yǎng)殖試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)基地進(jìn)行，挑選附肢完整、健壯活潑、初始體重為（17.39±1.20)g的克氏原螯蝦240尾，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾蝦。各組分別飼喂添加0(C0組，對(duì)照組）、200(C200組）、400(C400組）和800mg/kg(C800組）殼寡糖的試驗(yàn)飼料?？耸显r飼養(yǎng)于70.0cm×45.5cm×15.5cm的水族缸中，水族缸內(nèi)水深約5cm，并放入適當(dāng)?shù)木勐纫蚁≒VC）管作為隱蔽物。每日于09:00和17:00各投喂1次，投喂量為蝦體重的2%～3%，并根據(jù)蝦當(dāng)天的攝食狀況進(jìn)行調(diào)整，保證飽食。每天虹吸出殘餌及糞便，并更換充分曝氣的自來(lái)水，換水量約為總水量的1/3。試驗(yàn)期間，水溫保持在（25±1）℃，溶解氧含量≥6mg/L,pH為7.4～8.2，并使用增氧機(jī)連續(xù)充氧。試驗(yàn)期14d。1.3樣品采集和指標(biāo)測(cè)量1.3.1流動(dòng)離心檢測(cè)養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24h。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取6尾蝦，分別取其腸道和肝胰腺。將樣品稱重后，使用移液器吸取4倍于組織塊體積的磷酸鹽緩沖液（PBS），使用全自動(dòng)低溫組織研磨機(jī)充分勻漿后，使用冷凍離心機(jī)以2000r/min離心10min，取上清液于4℃冰箱中保存，并于24h內(nèi)測(cè)定。腸道和肝胰腺胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。1.3.2腸道菌群的測(cè)定養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24h。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3尾蝦，使用75%的酒精擦拭消毒，并在無(wú)菌操作條件下解剖取出完整的后腸，腸道樣品迅速置于液氮中冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，送至上海派森諾生物科技有限公司通過(guò)IlluminaMiSeq平臺(tái)對(duì)腸道菌群進(jìn)行高通量測(cè)序。16SrRNA的V3～V4區(qū)片段的擴(kuò)增引物為341F(5′-CCTAY-GGGRBGCASCAG-3′）和806R(5′-GGACTAC-NNGGGTATCTAAT-3′）。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理并得到優(yōu)化序列，對(duì)獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和操作分類單元（operationaltaxonomicunits,OTU）劃分，并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列?；贠TU進(jìn)行α多樣性分析（Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)），基于OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。1.3.3離心血淋巴制備養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24h。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取10尾克氏原螯蝦，使用1mL的無(wú)菌注射器從克氏原螯蝦頭胸甲后方插入心臟取血淋巴，注入1.5mL的離心管中，置于4℃冰箱中靜置過(guò)夜，使用冷凍離心機(jī)以4℃、3000r/min離心10min，取上清液置于-20℃冰箱中備用，并在24h內(nèi)測(cè)定。血清總抗氧化能力（T-AOC）及超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。1.4wssv攻毒試驗(yàn)養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，使用白斑綜合征病毒（whitespotsyndromevirus,WSSV）進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒所使用的WSSV由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院病毒實(shí)驗(yàn)室提供。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取出10尾克氏原螯蝦進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每組共30尾，從每尾克氏原螯蝦第2腹節(jié)肌肉注射1.0×101.5數(shù)據(jù)處理與分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用SPSS22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及單因素方差分析（one-wayANOVA），并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為P<0.05。2結(jié)果與分析2.1腸道淀粉酶活性如表2所示，飼料中添加殼寡糖能夠提高克氏原螯蝦腸道及肝胰腺中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性。C200組和C800組的腸道淀粉酶活性顯著高于C0組（P<0.05），其中，C200組的腸道淀粉酶活性最高；C200組、C400組和C800組的腸道脂肪酶、胰蛋白酶活性及肝胰腺淀粉酶、脂肪酶活性均顯著高于C0組（P<0.05），其中，C200組的腸道脂肪酶活性及肝胰腺淀粉酶活性最高，C800組的腸道胰蛋白酶活性及肝胰腺脂肪酶活性最高；C200組和C400組的肝胰腺胰蛋白酶活性顯著高于C0組（P<0.05），其中，C200組的肝胰腺胰蛋白酶活性最高。2.2地殼中的糖對(duì)原始海洋腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響2.2.1ce指數(shù)、shrenon指數(shù)如表3所示，C200組的Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)及Shannon指數(shù)均顯著高于C0組（P<0.05);C400組的Simpson指數(shù)顯著低于C0組（P<0.05);C800組的Shannon指數(shù)顯著低于C0組（P<0.05）。2.2.2各菌門相對(duì)豐度的變化各組的腸道菌群結(jié)構(gòu)在門水平上的組成如圖1所示，4個(gè)組的菌群組成在門水平上，主要由變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、軟壁菌門（Tenericutes）、放線菌門（Actinobacteria）等門類組成。各組中變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和軟壁菌門的相對(duì)豐度均達(dá)到90%以上，但是在各組所占比例有所不同。與C0組相比，C200組、C400組和C800組的變形菌門的相對(duì)豐度均有所下降，厚壁菌門、擬桿菌門和軟壁菌門的相對(duì)豐度均有所上升。各組的腸道菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上的組成如圖2所示，腸道菌群一共發(fā)現(xiàn)404個(gè)菌屬，其中主要有紅細(xì)菌屬（Rhodobacter）、擬桿菌屬（Bacteroides）、沙雷氏菌屬（Serratia）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、乳球菌屬（Lactococcus）等菌屬。選取各組中相對(duì)豐度排名前10位的菌屬，并計(jì)算其在各樣品中的比例如表4所示。在C0組中，紅細(xì)菌屬（40.17%）、乳球菌屬（11.67%）、沙雷氏菌屬（9.87%）為優(yōu)勢(shì)菌屬；在C200組中，紅細(xì)菌屬（31.39%）、沙雷氏菌屬（20.86%）、擬桿菌屬（13.19%）為優(yōu)勢(shì)菌屬；在C400組中，紅細(xì)菌屬（47.43%）、沙雷氏菌屬（13.83%）、擬桿菌屬（11.45%）為優(yōu)勢(shì)菌屬；在C800組中，擬桿菌屬（64.66%）、希瓦氏菌屬（17.95%）和紅細(xì)菌屬（7.09%）為優(yōu)勢(shì)菌屬。各組中相對(duì)豐度較高并且共有的菌屬有紅細(xì)菌屬、乳球菌屬、希瓦氏菌屬和擬桿菌屬，這4個(gè)菌屬總比例達(dá)到60%以上。紅細(xì)菌屬在C400組中比例最高，C800組中比例最低；擬桿菌屬在C0組中比例最低，在C200組、C400組和C800組中的比例都有所增加，并在C800組時(shí)達(dá)到最大；希瓦氏菌屬在C800組中的比例最高，在其他各組的比例都有所降低。2.3血清akp活性的比較c00組血清akp活性的相對(duì)分子活性c00如表5所示，各組之間血清T-AOC無(wú)顯著差異（P>0.05);C200組的血清SOD活性顯著低于C0組（P<0.05),C400組和C800組的血清SOD活性與C0組無(wú)顯著差異（P>0.05);C200組、C400組和C800組的血清AKP活性較C0組均有不同程度的提高，其中，C400組和C800組的血清AKP活性顯著高于C0組（P<0.05),C200組的血清AKP活性與C0組無(wú)顯著差異（P>0.05);C400組的血清ACP活性顯著高于C0組（P<0.05),C200組和C800組的血清ACP活性與C0組無(wú)顯著差異（P>0.05);C200組、C400組和C800組的血清CAT活性均顯著低于C0組（P<0.05）。2.4下降水平如圖3所示，感染W(wǎng)SSV后第7天，克氏原螯蝦的累積死亡率隨著殼寡糖添加水平的增加而下降。其中，C0組和C200組在第7天的累積死亡率均達(dá)到了63.33%,C400組和C800組在第7天的累積死亡率分別為36.67%和26.67%，相較于C0組分別降低了42.10%和57.89%。3討論3.1寡糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物肝胰腺及肝胰腺消化酶活性的影響消化酶活性在很大程度上反映出動(dòng)物從食物中獲取營(yíng)養(yǎng)的能力與效率，進(jìn)而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育情況當(dāng)前，有關(guān)于寡糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物肝胰腺的消化酶活性影響的報(bào)道不多，Sang等3.2殼寡糖對(duì)克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響蝦類消化道中的細(xì)菌大多是通過(guò)環(huán)境或者食物進(jìn)入消化道中定植并在此生長(zhǎng)繁殖的，并成為了蝦類消化道中重要的組成成分，與蝦體的健康密切相關(guān)。腸道利于細(xì)菌定植、環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定且營(yíng)養(yǎng)豐富，因此成為消化道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量最多的一個(gè)部位蔡雪峰等本試驗(yàn)中，各組克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)在門水平上主要由變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和軟壁菌門組成，這表明克氏原螯蝦的腸道菌群的組成在門水平上具有一定的保守性，但是各個(gè)門類分別所占的比例有所變化，說(shuō)明殼寡糖對(duì)克氏原螯蝦的腸道結(jié)構(gòu)起到一定的調(diào)節(jié)作用。張立強(qiáng)等通過(guò)對(duì)比各組克氏原螯蝦腸道菌群中相對(duì)豐度前10位的菌屬后發(fā)現(xiàn)，各組之間只有4種共有菌屬，并且各菌屬的比例也有較大差別，其比例與殼寡糖添加水平之間的關(guān)系并不明顯。紅細(xì)菌屬是一種廣泛存在于水體中的光合細(xì)菌，可以產(chǎn)生各種消化酶，協(xié)同動(dòng)物體本身的消化酶降解飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并提高免疫力與抗病力3.3殼寡糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的抗氧化酶系統(tǒng)甲殼動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有脊椎動(dòng)物那樣的引起特異性免疫的相關(guān)因子，因此非特異性免疫在克氏原螯蝦的免疫防御中發(fā)揮著極其重要的作用。SOD可以清除生物體內(nèi)多余的自由基，保證動(dòng)物機(jī)體內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)，還在抗衰抗炎方面有著重要的作用。CAT普遍存在于各種動(dòng)物體內(nèi)，在生物防御中起著維持氧化還原平衡起著重要的作用。AKP在蝦體內(nèi)主要由肝胰腺產(chǎn)生，在調(diào)控代謝方面有著重要的作用關(guān)于殼寡糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物非特異性免疫影響的結(jié)果并不一致。陳偉軍等3.4wsdv的概念白斑綜合征（whitespotdisease,WSD）是嚴(yán)重威脅蝦類養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的重要疾病之一，其病原為WSSV。WSSV是一種具有囊膜結(jié)構(gòu)的桿狀病毒4殼寡糖對(duì)克氏原螯蝦腸道菌群的影響(1)飼料中添加200mg/kg殼寡糖可以提高克氏原螯蝦腸道中的淀粉酶和脂肪酶活性及肝胰腺中的淀粉酶和胰蛋白酶活性，添加800mg/kg可以促進(jìn)克氏原螯蝦腸道中的胰蛋白酶活性及肝胰腺中的脂肪酶活性。(2)飼料中添加殼寡糖可以促進(jìn)克氏原螯蝦腸道中厚壁菌門