免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)

免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第1頁(yè)一試驗(yàn)原理以（抗體和抗原）之間專一性作用為基礎(chǔ)用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細(xì)胞內(nèi)生理性）相互作用有效方法。假如用蛋白質(zhì)X抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

問題：細(xì)胞怎樣保持生理狀態(tài)-不變性？Y-X-抗X免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第2頁(yè)CO-IP應(yīng)用與IP區(qū)分測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合確定一個(gè)特定蛋白質(zhì)新作用搭檔CO-IP與IP只取決于檢測(cè)焦點(diǎn)是初級(jí)靶分子（抗原）還是次級(jí)靶分子（相互作用蛋白）免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第3頁(yè)試驗(yàn)基礎(chǔ)原理1.提取蛋白2.在細(xì)胞裂解液中加入抗X抗體3.孵育后再加入ProteinA或G(于Agarosebead上)若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合目標(biāo)蛋白，就能夠形成復(fù)合物：“Y—X—抗X抗體—ProteinA或G"3.經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開。（xy抗原、x抗體）proteinA/G有一個(gè)很主要特征就是能與抗體Fc段結(jié)合agarosebead瓊脂糖珠免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第4頁(yè)CO-IP原理圖解免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第5頁(yè)proteinA/G-瓊脂糖珠復(fù)合物ProteinA是一個(gè)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動(dòng)物抗體（主要是IgG）Fc區(qū)結(jié)合。當(dāng)前多用proteinA/G預(yù)先結(jié)合在argarosebeads上。免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第6頁(yè)P(yáng)roteinA/G作用及詳細(xì)原理“捕捉”抗體，形成復(fù)合物，抗體-目標(biāo)蛋白-ProteinA/Gbeads非共價(jià)健結(jié)合ProteinA/G-garosebeads共價(jià)結(jié)合加樣緩沖液-煮沸變性-離心ProteinA/Gbeads↓EP管（抗體-目標(biāo)蛋白-少許非特異性吸附蛋白）。免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第7頁(yè)二CO-IP特征優(yōu)點(diǎn)（1相互作用蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾，處于天然狀態(tài)（2蛋白相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行，能夠防止人為影響（3能夠分離得到天然狀態(tài)相互作用蛋白復(fù)合物免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第8頁(yè)二CO-IP特征不足（1可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用（2兩種蛋白質(zhì)結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用；（3必須在試驗(yàn)前預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白是什么，以選擇最終檢測(cè)抗體，若預(yù)測(cè)不正確，試驗(yàn)就得不到結(jié)果。免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第9頁(yè)三試驗(yàn)流程

提取細(xì)胞總蛋白↓

↓離心，上清電泳(抗原抗體)準(zhǔn)備PA珠子，PBS洗3遍↓PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特異性蛋白背景)↓離心去PA珠子，取上清↓測(cè)蛋白濃度(BCA法)↓加一抗反應(yīng)(4℃過夜)↓加PA珠子捕捉復(fù)合物(室溫1h或4℃過夜)↓離心，搜集沉淀，預(yù)冷RIPABuffer洗3遍↓上樣緩沖液懸浮沉淀，加熱游離抗原、抗體、珠子

↓

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免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第10頁(yè)四試驗(yàn)結(jié)果分析SDSWesternblotting分析質(zhì)譜分析檢測(cè)目標(biāo)蛋白免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第11頁(yè)SDS結(jié)果分析標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上樣品分子量測(cè)定才含有可靠性。以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)數(shù)對(duì)它相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白遷移率即可測(cè)出其分于量。

免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第12頁(yè)一抗一抗一抗(兔抗Actin)

曝光后蛋白條帶二抗(辣根酶標(biāo)識(shí)羊抗兔IgG)ECLX光片曝光顯影ECL試劑含有轉(zhuǎn)印蛋白PVDF膜

++轉(zhuǎn)印膜上蛋白檢測(cè)示意圖

WB結(jié)果分析免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第13頁(yè)CO-IP與質(zhì)譜分析流程免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第14頁(yè)三試驗(yàn)關(guān)鍵1.試驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體性質(zhì)。尤其是多抗特異性是問題。2.為預(yù)防蛋白分解、修飾，溶解抗原緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行試驗(yàn)。3.考慮抗體/緩沖液百分比?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘余在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。4.確定蛋白間相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是因?yàn)榧?xì)胞溶解才發(fā)生，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)定位來確定。？？免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第15頁(yè)注意問題：1.裂解液細(xì)胞裂解采取溫和裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在全部蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采取非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細(xì)胞裂解條件是不一樣，經(jīng)過經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化cocktailer。免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第16頁(yè)RIPA裂解液--普利萊基因技術(shù)有限企業(yè)100mlRIPABuffer：50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40,0.1%SDS.（100元）說明：1.裂解液臨用前可新鮮加入最終濃度為1mMPMSF或其它蛋白酶抑制劑。2.RIPA裂解液中蛋白樣品含有較高濃度去垢劑，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法測(cè)定蛋白濃度免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第17頁(yè)裂解液成份我國(guó)博士：細(xì)胞裂解液：50mMTris-HC（lpH7.5），150mMNaCl,0.5%NP-40,1mMEDTA使用前加入PMSF至終濃度1mM、proteinaseinhibitorcocktail（混合物）。劉巖BC300buffer20mMTris-Cl,pH8.0,300mMNaCl,0.2mMEDTA,10%glycerol（甘油）,0.2mMPMSF,0.2%Tween20免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第18頁(yè)2.1免疫沉淀中抗體選擇免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第19頁(yè)注意問題：2.2抗體使用對(duì)照抗體：（陰性和陽(yáng)性）陰性：

單克隆抗體：同一個(gè)屬IgG

兔多克隆抗體：正常兔IgG陽(yáng)性：細(xì)胞內(nèi)某種蛋白抗體（做膜蛋白A，用膜蛋白B）免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第20頁(yè)未檢測(cè)到目得蛋白或蛋白極少可能原因 處理方法1.樣品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制劑；全部操作保持4℃以下冰上操作并預(yù)防凍融2.抗體濃度太低：調(diào)整抗體濃度，必要時(shí)設(shè)置濃度梯度，探索最正確濃度3.抗抗體親協(xié)力太低：選取適合于IP和/或IB對(duì)應(yīng)抗體4.IP抗體未與agarose珠子結(jié)合：選取適合于IP對(duì)應(yīng)珠子，正確保留預(yù)防變質(zhì)或干燥5.Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象表面：改變tag融合表示部位6.裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高：改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第21頁(yè)目得蛋白高背景：可能原因 處理方法非特異蛋白結(jié)合 在無血清培養(yǎng)液中裂解細(xì)胞；在免疫沉淀前用protein(G/A)珠子預(yù)洗，免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度（高鹽或去垢劑）裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低 改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液試驗(yàn)儀器或液體被污染 使用潔凈儀器或液體轉(zhuǎn)移膜上非特異吸附 戴手套，用鑷子夾取，不要接觸膜轉(zhuǎn)移面免疫共沉淀原理和注意事項(xiàng)第22頁(yè)試劑RIP