擴(kuò)張型心肌病相關(guān)基因的篩查與分析

擴(kuò)張型心肌病相關(guān)基因的篩查與分析

心肌病是一種異質(zhì)性心臟病，因其心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化而導(dǎo)致心力衰竭和死亡。1材料和方法1.1關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集（GSE42955）來(lái)自美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）公共數(shù)據(jù)平臺(tái)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）。下載心肌病相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集（/geo），該數(shù)據(jù)集基于GLP6244平臺(tái)，Affymetrix公司使用微陣列[HuGene-1＿0-st]HumanGene1.0STArray，檢測(cè)29例人心臟組織獲得數(shù)據(jù)，包括5例正常，12例擴(kuò)張型心肌病患者和12例缺血性心肌病患者。我們選擇正常組和擴(kuò)張型心肌病患者數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。1.2差異基因的go分析及蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析利用GEO2R在線分析工具（https://www.ncbi.nlm/geo/geo2r/?acc=GSE42955）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行DCM和正常心肌組織的差異基因篩選，篩選條件為P<0.05，其中Log利用在線生物信息學(xué)資源庫(kù)DAVID6.7對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集，以P<0.05為顯著富集，P值從小到大列出排名前10的GO功能族和KEGG信號(hào)通路，分析差異基因富集的生物功能、細(xì)胞組分、分子功能以及信號(hào)通路。利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)STRING(https：///）對(duì)篩選所得差異基因進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作（PPI）分析。在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)，節(jié)點(diǎn)間的連線代表蛋白間的相互作用。使用Cytoscape軟件（3.8.0）對(duì)蛋白質(zhì)互相作用的結(jié)果進(jìn)行可視化，并使用軟件中的MOCDE和CytoHubba插件通過(guò)12種方法篩選出連接度最高的前10個(gè)關(guān)鍵基因。2結(jié)果2.1肌病相關(guān)的差異基因通過(guò)GEO2R分析，篩選出57個(gè)與擴(kuò)張型心肌病相關(guān)的差異基因，其中25個(gè)下調(diào)、32個(gè)上調(diào)。差異基因火山圖中綠色表示下調(diào)基因、紅色表示上調(diào)基因，灰色表示無(wú)差異基因，如圖1。2.2細(xì)菌細(xì)胞來(lái)源及細(xì)胞組分富集通過(guò)DAVID6.7分析結(jié)果，GO富集顯示，差異基因主要涉及的生物學(xué)功能包括對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)、對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、節(jié)律過(guò)程、細(xì)胞對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路等（圖2-A）。細(xì)胞組分富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因主要存在于細(xì)胞外，涉及雙加氧酶活性、受體結(jié)合、核啟動(dòng)子結(jié)合等分子功能（圖2-B）。KEGG富集結(jié)果顯示，與心肌病相關(guān)的差異基因主要在非洲錐蟲(chóng)病、瘧疾、TNF信號(hào)通路上（圖2-C）。2.3cytoba優(yōu)化基因的篩選將篩選出來(lái)的差異基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：///），得到差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，共有55個(gè)節(jié)點(diǎn)，184條邊（如圖3）。使用Cytoscape3.8.0軟件對(duì)蛋白互作的結(jié)果進(jìn)行可視化，隨后使用軟件中的MCODE插件篩選子網(wǎng)絡(luò)，最后利用CytoHubba插件，通過(guò)12種算法篩選連接度最高的前10位的基因作為關(guān)鍵基因（圖4），分別為ICAM-1(細(xì)胞間黏附分子-1)、VCAM-1(血管細(xì)胞黏附分子-1)、FCGR-1A/B（免疫球蛋白-Fc受體IA/B）、IFI-30(干擾素γ誘導(dǎo)蛋白-30)、GBP-1/3/4(干擾素誘導(dǎo)鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白-1/3/4)、SEL-E(E選擇素）、CCL-2（趨化因子C-C基序配體-2）。3kegg及相關(guān)基因的表達(dá)擴(kuò)張型心肌病的臨床表現(xiàn)有不同的方式:75%～85%的患者有心衰的體征和癥狀，86%的患者運(yùn)動(dòng)時(shí)呼吸困難，30%的患者心悸，29%的患者外周水腫。在發(fā)病過(guò)程中，95%的患者出現(xiàn)心力衰竭癥狀。在4%～13%的患者中，開(kāi)始表現(xiàn)為無(wú)癥狀的心臟肥大本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到芯片數(shù)據(jù)集GSE42955，包括GO分析、KEGG通路富集分析和PPI網(wǎng)絡(luò)分析，利用GEO2R在線分析工具對(duì)該芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，DCM患者的心肌組織與正常人的心肌組織間的基因表達(dá)確實(shí)存在差異。為系統(tǒng)性分析DCM的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，本研究利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)DAVIDE對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)其生物過(guò)程、分子功能及信號(hào)通路主要富集在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，細(xì)胞通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)、對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路產(chǎn)生炎性因子，調(diào)節(jié)雙加氧酶活性、受體結(jié)合、核啟動(dòng)子結(jié)合等。KEGG富集結(jié)果顯示，與心肌病相關(guān)的差異基因主要在非洲錐蟲(chóng)病、瘧疾、TNF信號(hào)通路上。通過(guò)STRING進(jìn)行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，Cytoscape插件MCODE和CytoHubba計(jì)算，篩選出10個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镮CAM-1、VCAM-1、FCGR-1A/B、IFI-30、GBP-1/3/4、SEL-E、CCL-2。在擴(kuò)張型心肌病中，免疫異常長(zhǎng)期持續(xù)存在，并可能導(dǎo)致心肌的慢性炎癥。細(xì)胞黏附分子是在細(xì)胞表面表達(dá)的糖蛋白，使細(xì)胞之間互相接觸。ICAM-1、VCAM-1和SEL-E在炎癥早期的免疫過(guò)程具有重要的作用。有研究表明在DCM心肌組織中發(fā)現(xiàn)ICAM-1和VCAM-1在小鼠病毒性心肌炎(VMC)模型研究中發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞通過(guò)上調(diào)GBP-1，通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞從而抑制炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞的損傷，同時(shí)增加心肌細(xì)胞的活力IFI-30在免疫應(yīng)答中具有重要的生物學(xué)作用，通過(guò)刺激哺乳動(dòng)物的二硫鍵還原參與II類MHC限制性抗原的反應(yīng)過(guò)程。在豬的研究中發(fā)現(xiàn)IFI-30在脾、肝、肺、心、腸、血液和腎等組織均有表達(dá)，而且在脂多糖誘導(dǎo)脾和血液中IFI-30表達(dá)明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明IFI-30極有可能在豬的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用CCL-2是C-C趨化因子家族的一個(gè)成員，與C-C趨化因子受體-2(CCR-2）結(jié)合。CCL-2通常由巨噬細(xì)胞分泌，對(duì)傳染性病原體反應(yīng)，是白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞的有效趨化因子FCGR1A/B主要分布于單核-巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等表面?；罨腇cγRs在抗原遞呈細(xì)胞表面介導(dǎo)免疫復(fù)合物的吞噬作用并促進(jìn)TNF-α、IL-6等多