1,3-丙二醇發(fā)酵甘油合成甘油脫水酶的研究

1,3-丙二醇發(fā)酵甘油合成甘油脫水酶的研究

1甘油及甘油脫水酶1.3-丙二醇（1.3-propalm，以下簡稱1.3-pd）是重要的化工原料和化工材料。廣泛應(yīng)用于有機溶劑和添加劑中，尤其是用作單體合成聚醚、聚醚、聚醚等材料的材料。自然界中很多種微生物,如弗氏檸檬酸菌(Citrobacterfreundii)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricumclostrium)、克氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)等都能通過發(fā)酵甘油合成1,3-PD甘油脫水酶是甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD過程中的限速酶,它必須在輔酶VB本工作針對Klebsiellapneumoniae發(fā)酵甘油后期合成1,3-PD速率下降快的問題,較為系統(tǒng)地研究了外加能量對產(chǎn)物合成和甘油脫水酶活性的影響.2材料和方法2.1種子培養(yǎng)基和活性培養(yǎng)基實驗用菌種為克氏肺炎桿菌KlebsiellapneumoniaeL1(K.pneumoniaeL1),中國農(nóng)業(yè)大學(xué)贈送.好氧種子培養(yǎng)基碳源為葡萄糖,初始濃度20g/L;厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為甘油,初始濃度20g/L,其它組分同文獻[3].K.pneumoniaeL1先好氧培養(yǎng)6～8h,使OD2.2磷酸鉀緩沖液體系在厭氧培養(yǎng)基中添加適量ATPNa將厭氧培養(yǎng)指數(shù)生長期后期(約20h)的發(fā)酵液離心收集菌體,取適量加入30mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)體系,使體系組成為:輔酶VB2.3生物量的測量菌體濃度通過測定發(fā)酵液在650nm處的吸光度值OD2.43-hpa的測量甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD過程的中間產(chǎn)物3-HPA的測定借鑒甘油脫水酶酶活分析方法2.5高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的甘油、1,3-PD及副產(chǎn)物乙酸、乙醇、乳酸等采用SHIMADZU10A型高效液相色譜(島津制作所生產(chǎn))測定.色譜柱為AminexHPX-87H柱,柱溫653結(jié)果與分析3.1外源引發(fā)溫度對甘油脫水酶活性的影響利用外源添加的方式研究了ATP驅(qū)動對實驗菌株K.penumoniaeL1代謝過程的影響.外源能量對菌體生長的影響情況見圖1,圖中Control為沒有外源添加ATP的空白對照(下同).由圖可見,與對照相比,添加外源能量物質(zhì)在一定程度上抑制菌體的增長,這可能與長期的生物進化過程有關(guān).作為酶的天然載體和生存環(huán)境,微生物細胞都是以最經(jīng)濟和有利于自身的方式來對碳源和能源進行分配,通過調(diào)控各種酶的活性和表達量來合成所需的各種物質(zhì),并為細胞提供能量.在外加能源的情況下,菌體可以直接利用外源能量進行代謝,這在一定程度上削弱了菌體生長產(chǎn)能的驅(qū)動力.另外,ATP的加入也可能在一定程度上提高了甘油脫水酶的酶活,使甘油還原代謝途徑得到加強,中間產(chǎn)物3-HPA積累,對細胞產(chǎn)生毒害作用.3.2外源atp對k.pneumoniae合成1,3-pd的影響圖2(a)是在培養(yǎng)基中添加0.1～0.8g/LATP時K.pneumoniaeL1合成1,3-PD的情況.可見,外源ATP可不同程度促進1,3-PD的合成,而且越到發(fā)酵后期,促進作用越明顯.經(jīng)過72h厭氧培養(yǎng),外源添加0.6及0.8g/LATP可使1,3-PD濃度分別達到10.2和9.4g/L,比對照提高了50%～70%.另外還考察了單位菌體合成1,3-PD的情況,結(jié)果見圖2(b).在實驗范圍內(nèi),雖然外源ATP對菌體生長有一定的抑制,但單位菌體合成1,3-PD的能力提高了1倍左右,表明ATP對于菌體合成1,3-PD有非常重要的作用.在生物法合成1,3-PD的原始工藝中,菌體本身合成的ATP量較低,限制了甘油的還原代謝.因此,要提高1,3-PD合成能力,提高ATP的供給量是一個可行的思路.外源添加ATP對于K.pneumoniaeL1發(fā)酵甘油合成1,3-PD得率的影響見圖3,表明在發(fā)酵前期(0～24h),各實驗條件下1,3-PD得率差別不大,平均30%(ω)左右;24h之后(圖中虛線處),對照樣及添加較低濃度的ATP(≤0.4g/L)時1,3-PD得率迅速下降,而添加0.6～0.8g/LATP則能使1,3-PD得率維持在30%以上,發(fā)酵全過程的1,3-PD得率也相應(yīng)地由13%提高到30%以上.3.3atp對甘油脫水酶活性的影響前面的實驗結(jié)果表明,一定濃度的ATP促進了K.pneumoniae合成1,3-PD,單位菌體合成1,3-PD的量大大增加.這可能有兩種作用機制:一是ATP促使單位細胞表達的甘油脫水酶的量得到提高,二是ATP提高了甘油脫水酶在整個發(fā)酵過程尤其是發(fā)酵后期的平均比酶活.為了進一步了解ATP的作用機制,利用休止細胞,在不供給氮源的情況下遏制菌體生長和酶的進一步表達,即在酶量基本衡定的情況下,通過間歇添加ATP和輔酶的方式刺激催化活性下降的細胞使之恢復(fù)活性,結(jié)果如圖4所示.圖4(a)給出的是甘油脫水酶能量驅(qū)動復(fù)活過程中底物甘油及還原代謝產(chǎn)物1,3-PD和3-羥基丙醛(3-HPA)的濃度變化,圖中虛線處表示添加ATP及輔酶VB1,3-PD與3-HPA的加和可反映還原途徑消耗的甘油量,間接反映甘油脫水酶的活性.ATP驅(qū)動條件下甘油消耗及脫水酶活性變化情況如圖4(b)所示,由圖可見,3次補加ATP和輔酶后還原途徑對甘油的消耗明顯加快,而未添加ATP的對照實驗甘油代謝遲緩[圖4(a)],酶活得不到恢復(fù)[圖4(b)中虛線].這說明ATP促使甘油脫水酶進行了有效的復(fù)活,而且3次復(fù)活后甘油的還原代謝速率基本一致,說明失活的脫水酶經(jīng)ATP驅(qū)動復(fù)活后催化效率并沒有明顯下降,只要提供足夠的能量及輔酶,可望在整個發(fā)酵過程中甘油脫水酶的總體活性維持在較高的水平.繼續(xù)增加甘油脫水酶失活/復(fù)活的循環(huán)數(shù),結(jié)果如圖5.可見,多次“失活/刺激”后,酶活基本恢復(fù).文獻分析一般認為在實際發(fā)酵體系中超過15μmol/L的輔酶VB4外源atp對甘油還原代謝的影響發(fā)酵體系中添加0.6～0.8g/L生物能ATP,單位菌體細胞合成1,3-