低聚物乙醇對(duì)厭氧搖瓶中kpneumoniae生長(zhǎng)及1,3-丙二醇合成的影響

低聚物乙醇對(duì)厭氧搖瓶中kpneumoniae生長(zhǎng)及1,3-丙二醇合成的影響

1序言1.3-丙二醇（1.3-pd）是重要的溶劑和化工原料。它主要用于合成聚醚、聚醚和聚醚。2材料和方法2.1培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)所用菌株為KlebsiellapneumoniaeM5aL,由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送.好氧種子培養(yǎng)基及厭氧轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)碳源均為甘油,初始濃度30g/L,以2g/LCaCOK.pneumoniae先接種好氧種子搖瓶培養(yǎng),35℃,130r/min,以CaCO2.2測(cè)定細(xì)菌濃度菌體濃度通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液在650nm處的吸光度值OD2.3色譜分析測(cè)定發(fā)酵液中底物甘油及產(chǎn)物1,3-PD、副產(chǎn)物乙酸、乙醇、乳酸、2,3-丁二醇、琥珀酸(Succinicacid)等濃度均采用SHIMADAZU10A型高效液相色譜儀(島津制作所生產(chǎn))測(cè)定.色譜柱為AminexHPX-87H柱,柱溫65℃,流動(dòng)相為0.005mol/L的H發(fā)酵液中的NH2.4-pd比合成速率確定的計(jì)算菌體比生長(zhǎng)速率μ=dx/(xdt)=?x/(x?t)=?(lnx)/?t,取?t為盡可能小的時(shí)間間隔.菌體實(shí)際最大比生長(zhǎng)速率菌體在12～24h間的平均比生長(zhǎng)速率以上各式中x為菌體濃度,t為發(fā)酵時(shí)間,下標(biāo)12,24為時(shí)間(h).同樣的,1,3-PD比合成速率1,3-PD最大比合成速率12～24h間1,3-PD平均比合成速率以上各式中C3結(jié)果與討論3.1k.pneumoniae菌體生長(zhǎng)及1,3-pd合成實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)搖瓶厭氧實(shí)驗(yàn)研究了K.pneumoniae厭氧生長(zhǎng)及合成1,3-PD的情況.活化后的菌種先好氧培養(yǎng)過(guò)夜,然后以5%的接種量轉(zhuǎn)接厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基,通氮?dú)膺M(jìn)行厭氧培養(yǎng),每隔12h左右取樣測(cè)定菌體濃度及1,3-PD濃度,結(jié)果如圖1所示.K.pneumoniae厭氧培養(yǎng)時(shí)菌體生長(zhǎng)及1,3-PD合成大致可分為兩個(gè)階段,前36h菌體生長(zhǎng)及1,3-PD合成較快,36h后菌體濃度及1,3-PD濃度基本不再提高.菌體生長(zhǎng)停滯時(shí)1,3-PD的合成也隨之減緩.因此,要提高1,3-PD合成濃度,需避免菌體生長(zhǎng)過(guò)早停滯.3.2k.pneumoniae生長(zhǎng)代謝阻滯菌體生長(zhǎng)代謝過(guò)程中基質(zhì)不斷消耗.本工作中K.pneumoniae厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源主要是甘油,無(wú)機(jī)氮源主要是硫酸銨.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),2g/L硫酸銨完全可以滿足搖瓶實(shí)驗(yàn)的氮源消耗(見(jiàn)圖2),不是導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)代謝停滯的原因.由圖2可見(jiàn),K.pneumoniae厭氧發(fā)酵過(guò)程中甘油被不斷消耗,甘油消耗速率與菌體生長(zhǎng)、1,3-PD合成速率基本呈正相關(guān).本研究通過(guò)間歇補(bǔ)加甘油的方法,可以將甘油濃度控制在8～25g/L之間,發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的甘油足夠K.pneumoniae生長(zhǎng)及代謝利用,所以培養(yǎng)基中的碳源也不是導(dǎo)致K.pneumoniae生長(zhǎng)代謝停滯的主要因素.3.3代謝副產(chǎn)物對(duì)k.p.e菌體的生長(zhǎng)和1.3-pd的結(jié)合成的影響3.3.1發(fā)酵液中副產(chǎn)物的變化K.pneumoniae厭氧發(fā)酵時(shí),一部分底物甘油經(jīng)還原途徑轉(zhuǎn)化為1,3-PD,還有一部分甘油被氧化為丙酮酸,然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酸、乙醇、乳酸、2,3-丁二醇等.搖瓶厭氧發(fā)酵時(shí)主要副產(chǎn)物依次是乙醇、乳酸和2,3-丁二醇,乙酸和琥珀酸合成濃度很低.如圖3所示,發(fā)酵前期乙醇積累較多,發(fā)酵24h乙醇濃度超過(guò)4g/L,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),乙醇濃度略有下降,乳酸和2,3-丁二醇開(kāi)始積累,發(fā)酵液中乳酸和2,3-丁二醇濃度基本在36h達(dá)到較大值,與菌體生長(zhǎng)及1,3-PD合成曲線一致.3.3.2k.pneumoniae菌體生長(zhǎng)和代謝合成的影響由圖3可知,K.pneumoniae厭氧培養(yǎng)的前36h副產(chǎn)物乙醇、乳酸、2,3-丁二醇及乙酸的最高濃度分別為4.4,2.16,1.03及0.46g/L.以這些數(shù)值為基準(zhǔn)分別研究了其對(duì)K.pneumoniae生長(zhǎng)代謝的影響.(1)乙醇對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝的影響向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加乙醇,研究了乙醇對(duì)K.pneumoniae菌體生長(zhǎng)及1,3-PD合成的影響.分別在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中(0h)添加4或8g/L乙醇,或在培養(yǎng)12h后補(bǔ)加4或8g/L乙醇,不同實(shí)驗(yàn)方案發(fā)酵液中乙醇濃度變化如圖4所示.培養(yǎng)基中添加較高濃度乙醇時(shí),發(fā)酵液中乙醇量基本不再增加,甚至有所下降,這可能與乙醇自身的揮發(fā)及被菌體轉(zhuǎn)化利用有關(guān).總之在該實(shí)驗(yàn)條件下,發(fā)酵液中乙醇最高濃度可分別達(dá)到4或8g/L左右.表1顯示了不同乙醇濃度下K.pneumoniae的實(shí)際最大比生長(zhǎng)速率(μ另外,副產(chǎn)物乙醇及目的產(chǎn)物1,3-PD的還原性都高于底物甘油(2)副產(chǎn)物乳酸、2,3-丁二醇及乙酸對(duì)K.pneumoniae菌體生長(zhǎng)的影響厭氧搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中副產(chǎn)物乳酸、2,3-丁二醇及乙酸積累量較少(見(jiàn)圖3),實(shí)驗(yàn)證明該濃度對(duì)K.pneumoniae菌體生長(zhǎng)及1,3-PD合成不會(huì)產(chǎn)生明顯影響.但K.pneumoniae對(duì)這些物質(zhì)也具有一定的耐受性,將活化后的K.pneumoniae稀釋到一定濃度后分別涂布到含有不同濃度乳酸、2,3-丁二醇及乙酸的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)20h后培養(yǎng)基上單菌落數(shù)如表2所示.乳酸、2,3-丁二醇及乙酸對(duì)K.pneumoniae菌體生長(zhǎng)的抑制作用由強(qiáng)到弱依次是乙酸>2,3-丁二醇>乳酸,乙酸濃度僅2g/L即可對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制,達(dá)到5g/L以上時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)有顯著的抑制作用,2,3-丁二醇濃度不超過(guò)5g/L時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不大,而乳酸濃度高達(dá)10g/L時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)仍然無(wú)顯著影響.圖5是K.pneumoniae在發(fā)酵罐中厭氧培養(yǎng)的結(jié)果,副產(chǎn)物乙醇、乙酸的濃度在20h分別達(dá)到8和4g/L左右,此時(shí)菌體生長(zhǎng)及1,3-PD合成減緩(乳酸、2,3-丁二醇最高合成濃度分別為5及3g/L,對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝影響不大),而隨著乙醇、乙酸濃度進(jìn)一步提高,到40h以后菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成基本停滯.實(shí)際發(fā)酵現(xiàn)象與上述研究結(jié)果一致,進(jìn)一步說(shuō)明該工藝條件下K.pneumoniae厭氧發(fā)酵過(guò)程中主要副產(chǎn)物乙醇、乙酸的積累對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝有不利影響.乙酸在很多微生物發(fā)酵過(guò)程中都是主要代謝副產(chǎn)物之一搖瓶實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)酵液中副產(chǎn)物乳酸、2,3-丁二醇及乙酸積累濃度較低,不會(huì)對(duì)K.pneumoniae的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生明顯影響.但在發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中,副產(chǎn)物乙酸合成較多,對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝的影響是不可忽略的,因此需要考慮這些問(wèn)題,通過(guò)代謝調(diào)控等方法,降低副產(chǎn)物的抑制作用.4不同濃度的乙醇對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響K.pneumoniaeM5aL搖瓶厭氧培養(yǎng)時(shí)36h左右菌體生長(zhǎng)基本停滯,1,3-丙二醇合成速度開(kāi)始下降.研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中碳、氮源濃度不是造成菌體生長(zhǎng)代謝停滯的主要原因.K.pneumoniaeM5aL厭氧搖瓶培養(yǎng)時(shí)的主要副產(chǎn)物依次是乙醇、乳酸及2,3-丁二醇,乙酸和琥珀酸產(chǎn)量很低;該條件下乙醇的積累對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制,對(duì)1,3-PD的合成也明顯不利;8g/L乙醇可使菌的實(shí)際最大比生長(zhǎng)速率、1,3-丙二醇最大比合成速率、菌體濃度及1,3-丙二醇終濃度分別下降21.6%,22.1%,59.6%及33.5%;指數(shù)生長(zhǎng)期較高濃度乙醇對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝的抑制作用更加顯著.因此需要在后續(xù)的研究中對(duì)乙醇的合成進(jìn)行調(diào)控.K.pneumoniae對(duì)各種副產(chǎn)物的