高效氯氰菊酯誘導(dǎo)克氏原螯蝦肝胰腺損傷模型的建立

高效氯氰菊酯誘導(dǎo)克氏原螯蝦肝胰腺損傷模型的建立

氯氰菊酯，2-2-二氧基-3-（2-2-二氯乙烯基）-氰基-（3-羥色胺）-硝基。這是一種常見的農(nóng)藥，常用于清塘和海防寄生蟲。菊酯類農(nóng)藥對魚類、蝦蟹類等水生動物的毒性很高,會造成許多組織器官的病變本研究以克氏原螯蝦為試驗對象,用高效氯氰菊酯誘導(dǎo)克氏原螯蝦肝胰腺的損傷,探索克氏原螯蝦肝胰腺損傷模型的合適時間與濃度,篩選肝胰腺損傷程度評價指標,為研究克氏原螯蝦肝胰腺損傷的發(fā)生、發(fā)展,肝胰腺損傷的病理特征,以及評價肝胰腺損傷相關(guān)防治藥物等奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1生化指標及檢測試劑高效氯氰菊酯:購于武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司,藥品有效成分含量為4.5%,以此配置成母液,根據(jù)試驗需要稀釋成不同濃度試劑,現(xiàn)配現(xiàn)用。生化指標試劑盒:SYSMEXCHEMIX-180全自動生化分析儀配套試劑盒。抗氧化酶和氧化產(chǎn)物檢測試劑盒:南京建成生物工程公司生產(chǎn)的SOD(超氧化物歧化酶)酶試劑盒、CAT(過氧化氫酶)酶試劑盒和氧化產(chǎn)物MDA(丙二醛)試劑盒。蘇木精、伊紅染液:購買自武漢皮諾飛生物科技有限公司。1.2克氏原螯蝦生長克氏原螯蝦購自湖北省荊州市沙市農(nóng)場洪塘分場,選擇附肢完整、活力強、規(guī)格相近的克氏原螯蝦用于試驗,試驗用蝦體重(23±0.67)g。試驗開始前將克氏原螯蝦放入規(guī)格為(40cm×30cm×60cm)的水族箱中暫養(yǎng)7d,養(yǎng)殖水深10cm,試驗用水為經(jīng)充分曝氣3d的自來水,水溫(25±1)℃,連續(xù)充氣增氧以保證水中溶氧充足。每天投喂小龍蝦飼料2次(9:00和16:00),投喂量為蝦體重的1%～3%,每天清除殘餌與糞便并換水1/3,以保證水質(zhì)清潔。1.3試驗條件及程序建模濃度確定:根據(jù)文獻建模天數(shù)確定:克氏原螯蝦隨機放入水族箱,30尾/箱。試驗分成4組,設(shè)置2個試驗組和2個空白對照組,每組10尾蝦。試驗前克氏原螯蝦隔夜禁食。通過濃度確定試驗結(jié)果,選擇最適給藥濃度進行試驗,試驗條件同模型濃度確定試驗,觀察克氏原螯蝦的表現(xiàn)癥狀,于染毒后0.5、1、2、3、5、7、14d分別從空白組和試驗組采集6尾蝦取樣。肝胰腺損傷程度評價指標篩選與病理切片觀察:根據(jù)濃度確定試驗設(shè)置給藥濃度,給藥方法同建模天數(shù)確定試驗。在試驗第0.5、1、2、3、5、7、14天時從水族箱隨機采集6尾蝦,采集血清測定生化指標TP(血清總蛋白)、ALP(堿性磷酸酶)和GLU(血糖),采集肝胰腺測定超氧化物歧化酶SOD、CAT和氧化產(chǎn)物MDA和病理切片觀察。1.4樣品采集與測定1.4.1蝦肝胰腺的制備在各時間點取出克氏原螯蝦,稱重后用酒精擦拭頭胸甲部分,用無菌注射器從克氏原螯蝦圍心腔采集血淋巴,放入無菌離心管中,在4℃,10000r/min條件下離心10min,取上層血清于-20℃保存,用于測量生化指標。快速解剖取出蝦的肝胰腺,用預(yù)冷生理鹽水清洗,濾紙吸干;取一小部分放入福爾馬林中固定,用于制作病理切片;剩余部分置于-20℃冰箱保存,用于測定抗氧化酶和氧化產(chǎn)物。1.4.2抗氧化酶和抗氧化產(chǎn)物的測定血清生化指標測定:凍存血清置于4℃冰箱解凍,生化指標(AST、ALT、TP、ALP和GLU)測定使用SYSMEXCHEMIX-180全自動生化分析儀檢測。肝胰腺抗氧化酶和氧化產(chǎn)物測定:克氏原螯蝦肝胰腺樣品解凍后稱重,按照1∶9(W/V)比例加入預(yù)冷生理鹽水,用玻璃勻漿器制備10%的組織勻漿,在4℃、3000r/min條件下離心10min,取上清液,4℃保存并于1天內(nèi)進行測定。抗氧化酶指標SOD、CAT和氧化產(chǎn)物MDA的測定方法按照試劑盒說明書操作。組織病理切片觀察:肝胰腺經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后組織切片,切片厚度4～5μm,HE染色,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察。1.5計數(shù)方法及統(tǒng)計方法采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析,各組數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標準差。多組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法采用單因素方差分析(one-wayANOVA)法,當差異顯著時,采用Duncan′s法進行多重比較;兩兩數(shù)據(jù)的比較方法采用獨立樣本2結(jié)果與分析2.1高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦alt活性的影響由圖1可知,經(jīng)過不同濃度高效氯氰菊酯給藥后,與空白對照組相比,克氏原螯蝦血清AST活性在0.5、1d時所有實驗組皆沒有顯著變化;給藥2d后,僅0.02μg/L實驗組與空白對照組相比,AST活性有顯著升高。不同濃度高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦ALT活性的影響見圖1,0.02μg/L高效氯氰菊酯實驗組在0.5d時與對照組相比無顯著變化,在1d和2d時與對照組相比,ALT活性均顯著升高。其他濃度給藥組各時間點與對照組無顯著差異。根據(jù)試驗結(jié)果,確定0.02μg/L高效氯氰菊酯為建立克氏原螯蝦肝胰腺損傷模型的適宜染毒模型濃度。2.2各組ast活性的變化根據(jù)2.1的結(jié)果,采用0.02μg/L高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦進行給藥,各時間點克氏原螯蝦的血清AST和ALT活性見圖2。與空白對照組相比,染毒2d后實驗組AST活性開始顯著上升,至第3d達到峰值,差異極顯著。第7d時有所下降,但仍顯著高于空白對照組14d時AST活性和空白對照組之間已沒有顯著差異。實驗組AST活性第2天至第5天顯著高于0.5天實驗組的AST活性,總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。各時間點對照組AST值無顯著變化。與空白對照組相比,1d后實驗組的血清ALT活性顯著升高,3d時ALT活性達到峰值,在5d時開始下降并持續(xù)到第7d,但仍顯著高于空白對照組。第14天時實驗組ALT活性恢復(fù)至正常水平。實驗組ALT活性在第1天至第3d顯著高于0.5d實驗組的ALT活性,第5d時ALT活性接近0.5d時ALT活性,總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。各時間點對照組ALT值無顯著變化。根據(jù)試驗結(jié)果,在第3d時,血清轉(zhuǎn)氨酶活性與空白對照組相比有顯著變化;第3d時血清轉(zhuǎn)氨酶活性與實驗組0.5d時相比有顯著變化。因此確定3d作為克氏原螯蝦肝胰腺損傷模型的適宜染毒模型天數(shù)。2.3克氏原生殖蝦肝臟胰腺損傷程度評價指標的選擇2.3.1alp活性測定由表1可以看出,在試驗開始后至第2d,實驗組TP含量相比空白對照組略微下降,無顯著差異(根據(jù)表1,對比對照組ALP活性在2d時升高,第3d降低,第5d升高,變化均沒有顯著差異(2.3.2實驗組與空白對照組肝胰腺組織sod活性的變化高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦肝胰腺CAT活性影響隨時間變化情況如圖3所示,各時間點空白對照組CAT值無明顯變化(由圖3可知,與空白對照組相比,實驗組SOD活性在第2d開始顯著升高(根據(jù)結(jié)果,對比空白對照組,肝胰腺MDA的含量在試驗第2d顯著增加(2.4克氏原螯蝦肝臟組織結(jié)構(gòu)對0.20μg/L實驗組的不同時間的組織切片觀察發(fā)現(xiàn),試驗開始0.5d后,空白對照組克氏原螯蝦肝胰腺小管呈星形,結(jié)構(gòu)完整,細胞飽滿,分布均勻,肝管上可見少量棕色顆粒(圖4-1)。而0.5d后克氏原螯蝦肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡,與0.5d空白對照組比較,未見淤血或炎癥反應(yīng),肝管上棕色顆粒數(shù)量增多(圖4-2)。處理1d后切片顯示,克氏原螯蝦肝管排列緊密,肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡,肝管上可見少量棕色顆粒,與對照組比較,管腔未見明顯變窄(圖4-3)。2d時肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡,管腔未見明顯變窄,肝管上可見少量棕色顆粒,局部肝管排列疏松,間隙增寬,間質(zhì)可見少量炎性細胞滲出,炎癥反應(yīng)出現(xiàn)(圖4-4)。實驗組給藥3d時,肝管排列較緊密,肝管上可見少量棕色顆粒,肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡,少量液泡明顯增大,間質(zhì)偶見炎性細胞滲出(圖4-5)。第5d時,實驗組肝管上可見大量液泡,肝管上可見少量大液泡,并可見破裂后相互融合,肝管上可見少量棕色顆粒,肝管排列疏松,間隙大(圖4-6),肝細胞出現(xiàn)較明顯損傷且損傷不可逆轉(zhuǎn)。第7d時,肝細胞壞死溶解(黑色箭頭),可見棕色顆粒增多,肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡管腔變大(圖4-7)。實驗組14d時,棕色顆粒數(shù)量減少,肝細胞腫大,細胞數(shù)量明顯減少,肝胰腺小管基膜破裂,肝胰腺小管結(jié)構(gòu)受損嚴重(圖4-8)。3討論3.1血液中抗氧化酶系統(tǒng)tpALT主要存在于細胞質(zhì)內(nèi),而AST主要存在于線粒體和細胞質(zhì)中。正常情況下二者只有極少量釋放入血液,當肝組織受到急性損傷時,這兩種酶會隨組織損傷逸出臟器,使血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性顯著升高血清總蛋白TP為血清中所含各種蛋白質(zhì)的總稱,TP主要由肝臟合成,當血液中TP降低,則反映肝臟合成功能和肝實質(zhì)細胞儲備功能的下降3.2氯氰菊酯對克氏原生殖蝦肝胰腺的抗菌效果的影響SOD和CAT是機體抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶,MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物,這3個指標的變化能反