考氏科薩氏菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶活性質(zhì)初步研究

考氏科薩氏菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶活性質(zhì)初步研究

c.3.1.73，肉桂酸酯酶或肉桂枝酸酯酶，可分為抗膽紅素、糖乙酸酯和低聚糖亞硝酸鹽，屬于水楊酸酯水解酶的亞類。阿魏酸又名4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是一種存在于許多植物細(xì)胞壁中的一種重要的酚酸物質(zhì)，如高粱、蘆根、麥稈、麥麩、米糠、玉米皮、洋蔥皮、發(fā)酵茶等植物細(xì)胞壁中，具有抗氧化、抗血栓、抗輻射、抗血小板凝集、改善心腦血管健康、對(duì)老年人具有恢復(fù)和改善記憶等功能國(guó)外沒有固態(tài)發(fā)酵的釀制白酒方式，因此對(duì)白酒中阿魏酸的研究較少。國(guó)內(nèi)目前對(duì)阿魏酸的研究主要集中在飼料、紡織、造紙、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、生物能源等領(lǐng)域。隨著我國(guó)國(guó)民收入水平的提高，人們對(duì)生活質(zhì)量的要求也越來越高，在保障白酒安全生產(chǎn)的同時(shí)還要讓白酒有益于消費(fèi)者的健康，健康飲酒已經(jīng)成為中國(guó)白酒的新趨勢(shì)。利用科技力量，剖析傳統(tǒng)工藝白酒中的成分以及找尋天然植物中的健康成分。本試驗(yàn)以前期從濃香型白酒釀造過程中篩選出的一株產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株考氏科薩克氏菌（Kosakoniacowanii）為研究對(duì)象，對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究該菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活性質(zhì)及在麩皮、糟醅和大曲中的發(fā)酵應(yīng)用。本研究旨在為之后研究提高白酒中的阿魏酸含量奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料和試劑1.1.1菌株和材料考氏科薩克氏菌（Kosakoniacowanii）：本實(shí)驗(yàn)室保存；大曲、糟醅：瀘州某酒廠；麩皮：市售。1.1.2化學(xué)試劑NaCl、瓊脂粉、（NH1.1.3培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH1.2試驗(yàn)設(shè)備及設(shè)備LS-28HD立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；TGL-16M離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；HWS-260A恒溫恒濕培養(yǎng)箱：杭州綠博儀器有限公司；SPH-1102恒溫?fù)u床：上海世平試驗(yàn)設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1200型高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）儀：美國(guó)Agilent公司。1.3方法1.3.1粗酶液的制備菌株Kosakoniacowanii以1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于180r/min、32℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72h，發(fā)酵完后取9mL發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為10000r/min、4℃條件下離心10min，保留上清液，即獲得粗酶液。1.3.2相對(duì)酶活性的測(cè)定(1）酶的最適溫度及穩(wěn)定性取2mL緩沖液（pH6.0）于試管中，加入2mL1mmol/L阿魏酸甲酯溶液，分別放置于溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的水浴鍋中反應(yīng)5min，再分別加入1mL酶液，水浴20min，沸水滅酶終止反應(yīng)，混勻后以對(duì)照組為空白（失活的酶液）測(cè)定波長(zhǎng)320nm處的吸光度值，以酶活最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性將粗酶液分別放置于溫度為30℃、40℃、50℃、60℃的水浴鍋中保溫50min，每隔10min檢測(cè)一次酶活性，統(tǒng)一在50℃水浴鍋中反應(yīng)。以各溫度的初始酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性。(2）酶的最適pH及穩(wěn)定性取2mL緩沖液（pH2.6、3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0）于試管中，加入2mL1mmol/L阿魏酸甲酯溶液，置于50℃水浴鍋中反應(yīng)5min，再分別加入1mL酶液，在50℃水浴鍋中反應(yīng)20min，沸水終止反應(yīng)，混勻后以對(duì)照組為空白（失活的酶液）測(cè)定波長(zhǎng)320nm處的吸光度值，以酶活最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性。配制不同pH(3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0）緩沖液，與粗酶液等量混合，在4℃冰箱中放置2h，測(cè)定剩余酶活，以各pH值的初始酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。1.3.3初始ph值、溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響菌株Kosakoniacowanii預(yù)先進(jìn)行活化，以接種量分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%接種到培養(yǎng)基中，裝液量分別為30mL/250mL、60mL/250mL、90mL/250mL、120mL/250mL、150mL/250mL，初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0，分別置于溫度為28℃、31℃、34℃、37℃、40℃的搖床中，180r/min培養(yǎng)72h，檢測(cè)酶活，考察不同接種量、裝液量、初始pH值、溫度對(duì)酶活的影響，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣。1.3.4阿魏酸酯酶活測(cè)定法(1）阿魏酸酯酶酶活檢測(cè)檢測(cè)方法：取9mL發(fā)酵液10000r/min離心10min，取上清液，即獲得粗酶液。取2mL阿魏酸甲酯溶液和2mL檸檬酸緩沖液（pH6.0）在溫度為50℃水浴鍋中水浴5min，再加入1mL粗酶液，反應(yīng)20min，沸水滅酶終止反應(yīng)，以煮沸失活的酶液為空白，在波長(zhǎng)320nm條件下測(cè)定溶液吸光度值。阿魏酸酯酶酶活定義：1mL酶液在50℃、pH6.0條件下，每分鐘酯解阿魏酸甲酯，生成1μmol阿魏酸所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。(2）阿魏酸檢測(cè)檢測(cè)方法：在糟醅、大曲和麩皮三角瓶中加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇，所加體積分別為45mL、55mL、80mL，放置于溫度為30℃、180r/min的搖床中搖30min，然后10000r/min離心10min，獲得上清液，將上清液用0.22μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析。并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=-8.6333+53.9604x(R色譜條件：ZORBAXSB-Aq色譜柱（4.6mm×250mm,5μm），紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)320nm，柱溫25℃，流動(dòng)相為甲醇和5%醋酸（25∶75,V/V），流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL1.3.5阿魏酸含量測(cè)定麩皮與水的料液比為1∶1(g∶mL），將稱好的麩皮放入盆中，加水拌勻，稱取40g裝入三角瓶中，共8瓶，滅菌。將菌株進(jìn)行活化，以3%的接種量接種到滅菌的麩皮中，放置于溫度為34℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行有氧發(fā)酵，每天檢測(cè)阿魏酸含量，空白組為不加菌的麩皮。設(shè)置3個(gè)平行。(2）糟醅發(fā)酵稱取45g糟醅加入已滅菌的三角瓶中，用保鮮膜封口，共15瓶，分為兩組，一組為實(shí)驗(yàn)組，共7瓶，一組為對(duì)照組，每組8瓶。將菌株進(jìn)行活化，以3%的接種量接種到實(shí)驗(yàn)組中，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都放置于溫度為34℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，每天檢測(cè)阿魏酸含量，對(duì)照組不加菌。設(shè)置3個(gè)平行。(3）大曲發(fā)酵稱取35g大曲加入已滅菌的三角瓶中，共15瓶，分為兩組，一組為實(shí)驗(yàn)組，共7瓶，一組為對(duì)照組，每組8瓶。將菌株進(jìn)行活化，以3%的接種量接種到實(shí)驗(yàn)組中，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都放置于溫度為34℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行有氧發(fā)酵，每天檢測(cè)阿魏酸含量，對(duì)照組不加菌。設(shè)置3個(gè)平行。1.3.6數(shù)據(jù)處理及分析試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)注誤差表示，使用SPSS22.0進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異性顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵生酶條件優(yōu)化2.1.1裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖1可知，培養(yǎng)基裝液量對(duì)酶活是有影響的，當(dāng)裝液量為30～90mL/250mL時(shí)，隨著裝液量的增加而增加；裝液量達(dá)到90mL/250mL時(shí)，酶活最大，為28.27U/L；當(dāng)裝液量>90mL/250mL后酶活逐漸減小。因此，最適裝液量為90mL/250mL。2.1.2初始ph值對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖2可知，培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)于微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶都有一定的影響。不同的初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶是有影響的，該菌株在初始pH值為5.0～8.0范圍下均能產(chǎn)酶，在初始pH值為5.5時(shí)，酶活最大，約為27.34U/L。隨著初始pH值的增大，酶活呈遞減趨勢(shì)。因此，最適初始pH值為5.5。2.1.3著接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖3可知，不同的接種量對(duì)酶活是有影響的，隨著接種量在0.5%～4.0%范圍內(nèi)的提高，酶活隨之增高，當(dāng)接種量為4%，酶活最高，為27.12U/L；當(dāng)接種量>4%后，酶活減少。2.1.4著溫度3232時(shí)，各保鮮液酶的增殖由圖4可知，溫度的變化影響酶活的大小，隨著溫度在28～34℃范圍內(nèi)的升高，酶活呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)溫度為34℃時(shí)，酶活最高；當(dāng)溫度>34℃后隨著溫度的升高，酶活呈遞減趨。2.1.5初始ph的確定根據(jù)前面的研究，將菌株以4%接種量接種到培養(yǎng)基中，裝液量為90mL/250mL，初始pH為5.5，在溫度為34℃、180r/min條件下培養(yǎng)3d，檢測(cè)酶活。結(jié)果表明，優(yōu)化后酶活為28.27U/L，比優(yōu)化前提高了20.92%。2.2酶特征的研究2.2.1溫度對(duì)阿魏酸酯酶穩(wěn)定性的影響阿魏酸酯酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性，最適pH值及pH穩(wěn)定性分別見圖5和圖6。由圖5A可知，當(dāng)溫度<50℃時(shí)，酶活呈逐漸上升狀態(tài)，這是因?yàn)樵诖藴囟确秶鷥?nèi)，隨著溫度的升高，促進(jìn)了反應(yīng)速度；當(dāng)溫度為50℃，此時(shí)相對(duì)酶活最高為100%；當(dāng)溫度>50℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活呈下降狀態(tài)，這是因?yàn)檫^高的溫度會(huì)導(dǎo)致酶蛋白開始變形。因此，酶的最適溫度為50℃。由圖5B可知，阿魏酸酯酶在30～40℃范圍內(nèi)時(shí)穩(wěn)定性很好，在溫度為50℃時(shí)表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，50℃保溫50min后，酶活仍保留58.96%。但當(dāng)溫度為60℃時(shí)，阿魏酸酯酶穩(wěn)定性較差，保溫50min后殘余酶活不到20%。2.2.2酶最適ph的確定由圖6A可知，pH值為5.6時(shí)相對(duì)酶活最高為100%，兩邊呈遞減狀態(tài)，這是因?yàn)閜H會(huì)改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，進(jìn)而影響酶和底物的結(jié)合，而且過高或過低的pH都會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，從而使酶遭受不可逆的破壞。因此，酶的最適pH值為5.6。由圖6B可知，酶活在pH值為5.0～6.8范圍內(nèi)放置2h，其酶活穩(wěn)定性較好，殘余酶活均在80%以上，pH值在3.2～3.8范圍內(nèi)，酶活穩(wěn)定性較差。2.3蘑菇kosakoda2初步應(yīng)用2.3.1發(fā)酵過程中阿魏酸含量的變化由圖7可知，麩皮發(fā)酵提取液在1～7d，麩皮發(fā)酵釋放阿魏酸的含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)?？瞻捉M的麩皮阿魏酸含量為13.374μg/g，麩皮發(fā)酵至第7天時(shí)的阿魏酸含量為16.3715μg/g，比空白組的麩皮阿魏酸含量提高了22.42%，該菌株發(fā)酵麩皮產(chǎn)生的阿魏酸酯酶，能夠釋放麩皮中的阿魏酸，從而提高釋放的阿魏酸含量，說明菌株發(fā)酵能夠提高麩皮中阿魏酸的釋放。2.3.2酵母粉發(fā)酵過程中阿魏酸酯酶的釋放由圖8可知，第0天的糟醅發(fā)酵提取液中阿魏酸的含量為11.1366μg/g，接菌的糟醅發(fā)酵第一天的阿魏酸含量與發(fā)酵0d的糟醅發(fā)酵提取液中的阿魏酸含量相比有所增加，第二天之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)榍捌谌瞧恐泻醒鯕?，菌株能夠生長(zhǎng)，產(chǎn)生的阿魏酸酯酶釋放了糟醅中的阿魏酸，沒有氧氣后，糟醅中的阿魏酸不再被釋放，又因?yàn)榘⑽核岜环纸?，所以阿魏酸的含量逐漸減少。對(duì)照組中糟醅的阿魏酸被分解，含量逐漸減少，沒有上升的過程。說明菌株在前期有氧條件下能起到釋放阿魏酸的作用的；氧氣消耗完后，菌株停止產(chǎn)酶，阿魏酸含量逐漸降低。2.3.3阿魏酸酯酶檢測(cè)由圖9可知，第0天的大曲發(fā)酵提取液中阿魏酸的含量為4.0548μg/g，實(shí)驗(yàn)組中的阿魏酸含量呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組中接種的菌株產(chǎn)生阿魏酸酯酶，釋放了大曲中的阿魏酸，所以阿魏酸含量呈遞增趨勢(shì)。對(duì)照組中阿魏酸含量呈現(xiàn)先遞減后遞增的趨勢(shì)，出現(xiàn)遞增的趨勢(shì)可能是因?yàn)榇笄斜旧砗锌梢援a(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，使大曲中的阿魏酸被釋放出來，所以出現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。出現(xiàn)遞減的趨勢(shì)可能是因?yàn)榍捌诎⑽核岬姆纸馑俣却笥诎⑽核狨ッ羔尫虐⑽核岬乃俣龋猿霈F(xiàn)遞減的趨勢(shì)。但是對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組中的阿魏酸被釋放的含量較少，說明添加菌株有利于釋放大曲中阿魏酸，且能夠增加釋放阿魏酸的速度。3反應(yīng)溫度