姜黃素的抗炎作用及機制

姜黃素的抗炎作用及機制

0姜黃素治療髓損傷的方法目前，脊柱損傷的主要治療策略是抑制炎癥反應，促進神經(jīng)恢復。目前，姜黃素治療脊髓損傷的研究多采用腹腔注射的方法聚乳酸-羥基乙酸共聚物被廣泛應用于給藥系統(tǒng)以治療各種疾病，是目前研究最廣泛的可降解聚合物之一，它具有性質(zhì)可控、制備工藝明確、生物可降解性和生物相容性好等優(yōu)點1材料和方法1.1項目設計1.2時間和地點1.3材料表面1.3.1聚乳酸、聚己合成持續(xù)生物利用技術聚乳酸(大連美侖生物技術有限公司)；聚羥基乙酸(上海麥克林生物技術有限公司)；左旋聚乳酸(大連美侖生物技術有限公司)；聚己內(nèi)酯(大連美侖生物技術有限公司)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(相對分子質(zhì)量5×101.3.2儀器、試藥和儀器低溫冷卻循環(huán)水真空泵(鞏義予華，DLSZ-Ⅱ)；臺式數(shù)控超聲波清洗器(昆山舒美)；漩渦混勻器(IKA,Vortex4basic)；分散機(IKA,T18)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA,RV8FLEX)；真空泵(IKA,MVP10Basic)；混合/磁力攪拌器(IKA,RTC基本型)；臺式冰凍離心機(Eppendorf,5430R)；超低溫冰箱(海爾)；冷凍干燥機(Christ,ALPHA2-4)；安捷倫1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)；依利特C18色譜柱(4.6mm×200mm,5μm)；掃描電鏡(蔡司)。顯微鏡(荷蘭飛利浦)；SW-CJ-2F型超凈工作臺(蘇州凈化公司)；HettichROTOFIX32A離心機(Hettich公司)；CO1.4實驗方法1.4.1微球中姜黃素和聚合物的作用采用O/W乳化揮發(fā)法合成姜黃素微球，1、2號微球的原料為聚乳酸-羥基乙酸共聚物，預設載藥率分別為10%,20%;3、4號微球的原料為左旋聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物，預設載藥率分別為10%,20%。實驗分組見表1。預設載藥率為10%的微球按姜黃素與聚合物的質(zhì)量比1∶9稱取，預設載藥率為20%的微球按姜黃素與聚合物的質(zhì)量比1∶4稱取。將姜黃素與聚合物同時溶于50mL二氯甲烷中，避光保存直至完全溶解，超聲震蕩充分混勻形成油相。配置300mL2%的聚乙烯醇溶液作為水相，將油相緩慢加入配置好的2%聚乙烯醇溶液中，高速分散機8300r/min分散，制備乳液；二次分散后，常溫攪拌12h(完全封蓋攪拌4h，敞口8h)，置于冰水浴中2h,4000r/min離心，取沉淀物，冷凍干燥得到微球。1.4.2掃描電鏡觀察將姜黃素原藥及4種姜黃素微球黏貼在貼有導電膠帶的樣品臺上，吸耳球吹去未粘住的粉末，噴金鍍膜處理，隨后放在掃描電鏡下觀察外觀。掃描電鏡條件ETH=10kV,WD=12mm,IProbe=100pA。1.4.3檢測波長和溫度(1)高效液相色譜條件：依利特C18色譜柱(4.6mm×200mm,5μm)，流動相為0.1%冰醋酸溶液-乙腈(45/55)，流速為1mL/min，檢測波長為425nm，溫度為30℃，進樣量為20μL。(2)標準曲線的繪制：配置質(zhì)量濃度分別為500,100,50,25,10,5,1,0.5,0.25mg/L的姜黃素的甲醇標準品溶液，在高效液相色譜條件下測定峰面積(a)，以峰面積(b)對質(zhì)量濃度(c,mg/L)進行線性回歸，得到姜黃素的標準曲線。1.4.4冰醋酸-乙腈溶液準確稱取5mg4種姜黃素緩釋微球，放置于15mL離心管中，用10mL乙腈使其完全溶解，取1mL溶解后的溶液放置于一個新的15mL離心管中，并用配置好的0.1%冰醋酸-乙腈溶液(50∶50)稀釋10倍。利用高效液相色譜測得稀釋后溶液的峰面積，通過標準曲線方程計算得到姜黃素含量，每組樣品設3個平行樣，計算出4種姜黃素緩釋微球載藥率和包封率。包封率(%)=(投入總藥量-上清中藥物含量)/投入總藥量×100%載藥率(%)=微球中的藥量/稱得的微球質(zhì)量×100%1.4.5藥物釋放曲線方程體外釋放：準確稱取10mg姜黃素微球，放置在盛有10mLPBS(含有1%十二烷基硫酸鈉，pH=7.4)的15mL離心管中，密封后放置在震蕩培養(yǎng)箱中恒溫震蕩(37℃，150r/min)，分別于2,4,8,12,24h離心取樣5mL，利用高效液相色譜檢測其中的藥物含量，并同時補充含有1%十二烷基硫酸鈉的PBS(pH=7.4)5mL，維持狀態(tài)，觀察比較4種微球24h內(nèi)的釋放效果。在實驗的21d內(nèi)，每天離心取釋放外液5mL，利用高效液相色譜檢測其中的藥物含量，并同時補充含有1%十二烷基硫酸鈉的PBS(pH=7.4)5mL，計算微球累積釋放率，繪制藥物釋放曲線。釋放曲線方程擬合：將上述所得數(shù)據(jù)進行整理，設時間為T，累積釋放率為Y，并按照固定算法進行方程擬合。以橫坐標T、縱坐標為Y進行擬合得到零級方程；以橫坐標T、縱坐標ln1.5比較方法：多組間差異比較實驗數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism進行統(tǒng)計分析，兩組間差異比較用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析。P<0.05認為差異有顯著性意義，統(tǒng)計圖采用GraphPadPrism統(tǒng)計繪制。2結(jié)果的結(jié)果2.1姜黃素原藥和姜黃素緩沖微球的性能2.4姜黃素緩沖微球的外部釋放與方程調(diào)整2.4.1藥物累積釋放率在24h內(nèi)，2、4號微球第1小時的藥物釋放濃度較高，然后趨于平穩(wěn)，1、3號微球各時間點的藥物釋放濃度基本保持同一水平，見圖5A。在24h內(nèi)，1-4號姜黃素緩釋微球的藥物累積釋放率分別為(27.3±1.2)%,(19.2±0.8)%,(22.1±0.5)%,(28.5±0.7)%，見圖5B。從21d釋放濃度來看，2、4號微球的波動范圍較大，1號雖穩(wěn)定但釋放濃度偏低，3號微球最穩(wěn)定，見圖5C。3號姜黃素緩釋微球的體外釋放可持續(xù)14d，其余3種微球的體外釋放可持續(xù)21d,1-4號微球的藥物累積釋放率分別為(101.1±1.2)%,(79.1±0.8)%,(101.3±0.5)%,(94.2±0.7)%，見圖5D。2.4.2姜黃素微球的釋放曲線方程的調(diào)整以上方程式中，M3聯(lián)動聚乳酸-聚己內(nèi)酯社會聚乳酸微球與聚乳酸-羥基乙酸社會聚合物的合成此次實驗基于兩種聚合物材料合成微球，利用O/W乳化揮發(fā)法合成姜黃素微球，對實驗方法做了適當改進，調(diào)整延長了制備乳液以及二次分化的時間，有效增加了微球制備的成功率。治療脊髓損傷的釋放效果符合零級釋放可提高后續(xù)實驗的可信度。根據(jù)方程擬合結(jié)果，3號姜黃素微球，即左旋聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物合成的預設載藥率10%的姜黃素緩釋微球，緩釋效果最接近零級釋放要求。脊髓損傷中炎癥一般在損傷后開始出現(xiàn)，在第7天達到高峰，持續(xù)近14d，根據(jù)釋放天數(shù)來看，盡管3號微球的體外釋放僅為14d，但足以覆蓋整個脊髓損傷炎癥的急性反應期。此外，姜黃素在體內(nèi)的半衰期僅為兩三小時，合成的3號姜黃素緩釋微球接近零級釋放要求，即恒量釋放，不隨時間的變化而變化，這有效解決了姜黃素體內(nèi)半衰期短、消除過快的缺點，有利于提高治療效果，同時也可能解決反復腹腔注射帶來的潛在風險。掃描電鏡顯示，相比于1、2號姜黃素緩釋微球，3、4號姜黃素緩釋微球的粒徑基本一致，形態(tài)更加規(guī)則，因此左旋聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物合成的姜黃素緩釋微球的效果優(yōu)于聚乳酸-羥基乙酸共聚物。姜黃素緩釋微球也被多人研究合成，朱雯潔等實驗分別以聚乳酸-羥基乙酸共聚物、左旋聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物合成4組姜黃素緩釋微球，有助于解決姜黃素半衰期短、體內(nèi)清除速度快等缺點，提高其生物利用度且緩釋效果明顯，并且左旋聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物合成的微球效果優(yōu)于聚乳酸-羥基乙酸共聚物。此外，此次合成的姜黃素微球，4號微球的藥物與材料比例可能未到達最佳，導致部分藥物未包進微球，而是附著在微球表面，導致其包封率沒有與3號微球保持一致，這有待后續(xù)實驗進一步驗證。綜上所述，以左旋聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物合成的預設載藥率10%的姜黃素微球為最優(yōu)選擇，但是藥物在體內(nèi)代謝過程比較復雜，體外釋放行為并不能完全代表其在體內(nèi)的藥物動力學行為，因此合成的姜黃素微球的體內(nèi)代謝過程有待進一步研究。作者貢獻：黃飛、孟永春、李希凱進行實驗設計，實驗實施為孟永春、李希凱、劉卿、王笑，實驗評估為付麗、資料收集為谷成旭、付麗，李希凱成文，黃飛審校。經(jīng)費支持：該文章接受了“山東省自然科學基金(ZR2017MC052)及國家自然科學基金(81870985)”的資助。所有作者聲明，經(jīng)費支持沒有影響文章觀點和對研究數(shù)據(jù)客觀結(jié)果的統(tǒng)計分析及其報道。利益沖突：該研究遵守國際醫(yī)學期刊編輯委員會《學術研究實驗與報告和醫(yī)學期刊編輯與發(fā)表的推薦規(guī)范》。寫作指南：該研究遵守國際醫(yī)學期刊編輯委員會《學術研究實驗與報告和醫(yī)學期刊編輯與發(fā)表的推薦規(guī)范》。文章查重：文章出版前已經(jīng)過專業(yè)反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：文章經(jīng)小同行外審專家雙盲外審，同行評議認為文章符合期刊發(fā)稿宗旨。生物統(tǒng)計學聲明：該文統(tǒng)計學方法已經(jīng)濱州醫(yī)學院生物統(tǒng)計學專家審核。文章版權：文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協(xié)議。開放獲取聲明：這是一篇開放獲取文章，根據(jù)《知識共享許可協(xié)議》“署名-非商業(yè)性使用-相同方式共享4.0”條款，在合理引用的情況下，允許他人以非商業(yè)性目的基于原文內(nèi)容編輯、調(diào)整和擴展，同時允許任何用戶閱讀、下載、拷貝、傳遞、打印、檢索、超級鏈接該文獻，并為之建立索引，用作軟件的輸入數(shù)據(jù)或其它任何合法用途。體外觀察性實驗，多組間差異比較采用單因素方差分析。實驗于2019年10月至2020年10月在山東濱州醫(yī)學院煙臺校區(qū)人體解剖與組織胚胎學實驗室完成。姜黃素(相對分子質(zhì)量368.37，大連美侖生物技術有限公司)；乙腈(色譜純)；其他試劑均為分析純。1.3.3主要實驗設備姜黃素微球的載藥率、包封率及緩釋效果。1.6c涂層微球大小及檢測限、定量限掃描電鏡顯示，姜黃素原藥呈晶塊狀，見圖1A;4組姜黃素緩釋微球外觀呈球狀，其中由聚乳酸-羥基乙酸共聚物合成的微球大小差異較大，粒徑分布不均，見圖1B、C；由左旋聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物合成的微球大小差異較小，粒徑分布比較均勻，見圖1D、E。姜黃素出峰位置大約為7.9min，見圖2，其含量測定的最低檢測限為0.2mg/L，最低定量限為0.25mg/L。以峰面積(1-4號姜黃素緩釋微球的包封率依次為(78.07±2.05)%,(74.17±4.05)%,(94.27±2.14)%,(74.1±3.89)%,3號微球的包封率高于其他3組微球(2.3黃酮緩沖微球的包封率和載劑率2.2姜黃素標準曲線的繪制見表2,3。反復注射姜黃素文章特點—△姜黃素應用于大鼠脊髓損傷治療以往一般采取的策略為腹腔注射。由于姜黃素在體內(nèi)半衰期較短、清除速度快，所以需反復腹腔注射?！鲗嶒灷肙/W乳化揮發(fā)法，對其稍加改良，分別采用聚乳酸-羥基