污泥還原態(tài)老菌的電子穿梭功能

污泥還原態(tài)老菌的電子穿梭功能

水生有機物質（pm）通常是操作中的定義。這些材料在浸泡后可通過0.45m的濾膜中處理，具有不同結構和劑量的有機化合物的連續(xù)體或混合體。不僅含有低含量游離氨基酸、糖和酸，還包括高劑量腐殖質、氨基糖和多酚。地球生態(tài)系統(tǒng)中非常活躍的有機成分。它不僅影響重金屬、養(yǎng)分元素和有機污染物的激活、遷移和生態(tài)毒性，而且與不利因素和養(yǎng)分的風化、成土過程以及土壤有機質的分解和轉化密切相關。長期以來,有關DOM的研究集中于吸附與絡合屬性,重點是它對重金屬和有機污染物遷移擴散的影響.但最近DOM的氧化還原屬性逐漸成為研究熱點.2007年,Bauer等首先提出DOM作為氧化還原緩沖劑的概念,采用化學還原劑(金屬Zn和H2S)與氧化劑(絡合態(tài)三價鐵),分別測定了電子接受量(electronacceptingcapacities,EAC)和電子供給量(electrondonatingcapacities,EDC),以及這一過程中電子轉移能力.結果表明,以腐殖質為模型物的DOM溶液的氧化還原緩沖范圍為-0.9～+1.0V.熒光光譜、電子自旋共振光譜和電化學等方法研究表明,DOM的氧化還原性主要是由于DOM結構中普遍存在的醌基.近年來研究表明,自然界中普遍存在一類醌還原菌(又稱腐殖質還原菌),它是一類以腐殖質中的醌基作為唯一末端電子受體,進行厭氧胞外呼吸的微生物.它們可以多種有機物(如有機酸、糖類等)為電子供體,將電子傳遞鏈上的電子傳給腐殖質中的醌基,醌基再將電子傳給其他電子受體(如鐵氧化物),從而驅動電子轉移.本研究以1株醌還原菌——中國希瓦氏菌(Shewanellacinica)D14T作為電子轉移驅動力,考察了DOM被D14T菌株還原后的電子供給量(EDC),測定DOM的氧化還原活性,以及DOM對D14T還原難溶性鐵氧化物的影響,以期為進一步分析DOM在元素循環(huán)、污染物的降解以及生物地球化學電子轉移反應中的作用提供科學依據(jù).1材料和方法1.1dm材料的表征取一定體積廣州某污水處理廠濃縮污泥(含固率3.28%),在4℃下,13000r/m離心20min,上清液過0.45μm濾膜,濾液中的有機物即為DOM(相關性質見表1),其pH由pH計測得,濃度以水溶性有機碳(dissolvedorganiccarbon,DOC)表示,由TOC儀(TOC-VCPH,島津)測定,然后用超純水將DOM的濃度(以C計,下同)稀釋到100mg·L-1,避光冷藏備用.SUVA值是UV254與DOC的比值,該值可表征DOM的分子量大小、芳構化或腐殖化程度.1.2電子供給量cfe2的制備EDC是指DOM作為電子供體可提供的電子數(shù)量.通過測定其對Fe(Ⅲ)凈還原量,計算每g有機碳(DOC)所轉移的電子數(shù)(e-/C),e-/C的單位:μmol·g-1.為了描述DOM電子轉移過程,本研究將D14T轉移電子至DOM的過程定義為DOM還原階段;DOM轉移電子給Fe(Ⅲ)定義為DOM氧化階段(圖1).氧化階段又分2種情況:①初始電子供給量,即DOM提取后未被空氣氧化直接還原Fe(Ⅲ)所測得的量;②潛在電子供給量,即初始DOM被微生物還原后,還原態(tài)DOM將電子轉移給Fe(Ⅲ)所測得的量.實驗選用中國希瓦氏菌D14T,因為其厭氧條件下可以利用多種有機酸鹽和甲苯等污染物作為電子供體,以腐殖質作為唯一末端電子受體進行厭氧呼吸.在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液于4℃下,6000r/min離心收集菌體,用已滅菌去離子水洗滌菌體2次,然后重懸于其中制成菌懸液,并用梯度稀釋平板計數(shù)法計數(shù)(個/mL).在無菌操作臺,往20mL西林瓶(含9mL無菌去離子水)加入菌懸液(109個/mL)、乳酸鹽(電子供體)和DOM,控制處理未加電子供體,最終溶液總體積15mL,3個平行,充氮氣(99.99%)15min,壓蓋蔽光30℃恒溫培養(yǎng)(24±1)h,這稱為DOM還原階段.DOM電子供給量(EDC)的測定參考了Lovley等和Heitmann等實驗方法,并進行了相應修改.2mL0.1mol·L-1乙酸鈉緩沖液[含0.5mmol·L-1FeCl3或Fe(citrate),縮寫為FeCi],pH5.87,先通氮氣15min去氧,然后在Bactron-Ⅰ型厭氧工作站內(N2∶CO2體積比為80∶20,美國shellab)加入2mL還原態(tài)DOM濾液(過0.2μm膜),2個平行,控制處理不加FeCl3或FeCi,空白不加DOM濾液,壓蓋放入搖床220r/min,蔽光30℃恒溫培養(yǎng)(24±1)h,這稱為DOM氧化階段.采用鄰菲啰啉分光光度法測定溶液中Fe2+濃度.0.1%鄰菲啰啉預先通氮氣30min去氧,厭氧下每個樣品注射4mL鄰菲啰啉,顯色10min后,510nm下比色(TU-1800PC型紫外可見分光光度計).凈產(chǎn)生的Fe2+量可由下式求得:cFe2+=cFeCl3/FeCi?ccontrol?cblank(1)cFe2+=cFeCl3/FeCi-ccontrol-cblank(1)1.3通過測定廢水通道的還原氧化過程1.3.1還原態(tài)要物的制備DOM在相同的條件下,進行重復的還原-氧化反應,以還原態(tài)DOM的EDC來表征.首先,DOM(30mg·L-1)被D14T還原,還原態(tài)DOM在厭氧下過濾,部分樣品濾液測其EDC(方法同1.2),剩下樣品的濾液通無菌的空氣30min,使還原態(tài)DOM轉變?yōu)檠趸瘧B(tài)DOM;然后重新加入菌和電子供體,充氮氣15min,壓蓋培養(yǎng),DOM再次被還原,厭氧下過濾DOM,部分樣品濾液測其EDC,剩下樣品的濾液通無菌的空氣30min;接著再次重新加入菌和電子供體,充氮氣15min,壓蓋培養(yǎng),厭氧下過濾DOM,測其EDC.1.3.2試條件及試劑條件在CHI605C電化學分析儀(上海辰華儀器公司)上測定,采用三電極體系電解槽.測試條件:電解質為1.0mmol·L-1NaClO4,溶劑為二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO),工作電極為直徑3.0mm的Pt圓柱,輔助電極鉑絲,參比電極Ag/AgCl.DOM溶液冷凍干燥后溶于二甲基亞砜.具體步驟參考文獻.1.4fe濃度的測定水鐵礦溶液(pH7.0,終濃度12mmol·L-1,121℃濕熱滅菌20min)加入D14T菌懸液(108個/mL)、乳酸鹽和DOM,空白即水鐵礦溶液,控制處理不加DOM或不加乳酸鹽,充N215min后壓蓋,30℃恒溫避光培養(yǎng),定時取樣測定Fe(Ⅱ).采用鄰菲啰啉分光光度法測定溶液中Fe(Ⅱ)濃度,先用0.5mol·L-1HCl提取,放搖床220r/min,90min,過濾,顯色10min后,510nm下比色.2結果與討論2.1電子轉移過程中電子引導效果圖2反映了污泥DOM經(jīng)D14T菌株還原前后的電子供給能力.初始EDC是DOM直接作為電子供體,不進行微生物還原,所測得電子供給量.DOM初始EDC很小,說明DOM初始狀態(tài)以氧化態(tài)為主.潛在EDC是指污泥DOM從D14T菌株電子呼吸鏈上獲得電子成為還原態(tài),然后還原態(tài)DOM再轉移電子給可溶的Fe(Ⅲ),測得電子供給量.在沒有外加電子供體(乳酸鹽)下,D14T的加入提高了污泥DOM的EDC值,由初始2.2μmol·g-1和14μmol·g-1增加到247μmol·g-1和159μmol·g-1,分別為FeCl3和FeCi所測結果,EDC的增加可能是DOM中存在一些小分子物質(如有機酸、氨基酸等)被菌利用.在D14T和乳酸鹽同時存在下,DOM潛在EDC比未加電子供體(只有菌)的要多40.5%(FeCl3測得)和59.2%(FeCi測得),說明D14T可以轉移電子給DOM,DOM接受電子后可再次轉移出來,且在這一電子轉移過程中D14T菌體增加一個數(shù)量級(數(shù)據(jù)未列出),說明D14T在轉移電子過程中獲得能量支持生長.許志誠等研究也表明,D14T以乳酸鹽為電子供體還原腐殖質過程中可以獲得能量支持生長.從圖2還可看出,總體上FeCl3測試的結果比FeCi測試的結果要高很多.FeCl3溶解于水后,以水合離子形式存在于溶液中,而FeCi溶解于水后是以絡合形式存在于溶液中.Fe3+/Fe2+半反應的標準電勢為0.77V,[Fe(citrate)]0/[Fe(citrate)]1-半反應的電勢為0.391V,電勢高的容易被還原,所以FeCl3中Fe(Ⅲ)易于被還原,這與測試的結果相符.但初始EDC測試的結果正好相反,可能是菌的加入影響了DOM或者存在其他作用,需更深入研究.2.2電化學表征圖3為污泥DOM在3次氧化還原循環(huán)過程中的電子供給量.DOM先被菌株D14T還原,然后還原態(tài)DOM被氧氣氧化,在相同的條件下,進行重復的還原-氧化反應,以潛在電子供給量(EDC)來表征.結果表明,污泥DOM經(jīng)歷3次還原-氧化循環(huán)后,潛在EDC能穩(wěn)定維持在150～250μmol·g-1之間,說明DOM可以被重復利用,反復轉移電子.這與Ratasuk等利用氧氣(氧化劑)和氫氣(還原劑)研究腐殖質氧化還原性的結果相似.圖4為DOM溶于有機溶劑DMSO測得循環(huán)伏安圖,有2對氧化還原峰:氧化峰A1和還原峰C1,氧化峰A2和還原峰C2,即陽極發(fā)生2次氧化(失電子),陰極發(fā)生2次還原(得電子).空白掃描顯示DMSO不產(chǎn)生氧化還原峰,而電解質NaClO4作為導電媒介也不會產(chǎn)生氧化還原峰,所以出現(xiàn)的2對氧化還原峰應源于DOM.Nurmi等用循環(huán)伏安法測試醌模型物蒽醌-2,6-二磺酸(anthraquinone-2,6-disulfonate,AQDS)也出現(xiàn)了2對氧化還原峰,表示AQDS發(fā)生相繼的單個電子轉移,即Q+e??Q???Q??+e??Q=(QQ+e-?Q?-?Q?-+e-?Q=(Q代表醌,Q·-代表半醌自由基,Q=代表對苯二酚).由此可見,DOM在這一循環(huán)中也發(fā)生了類似的電子轉移.標準條件下,可逆的電化學反應CV呈現(xiàn)陽極和陰極對峰,兩峰電勢的差(ΔEp)等于0.059/nV(n是轉移電子數(shù)),陽極與陰極的峰電流比(IAppA/ICppC)接近1.A1與C1的ΔEp為0.181V,A2與C2的ΔEp為0.602V;A1與C1的IAppA/ICppC為0.7,A2與C2的IAp/ICp為0.4.這些結果表示ΔEp>0.059/nV,IAppA/ICppC<1,與標準條件下不一致,這可能與Fe(Ⅱ)-DOM和Fe(Ⅲ)-DOM絡合物有關.由表1可知污泥DOM中鐵的含量相對較高.在陰極掃描時Fe(Ⅲ)-DOM絡合物被還原,可能引起Fe(Ⅱ)-DOM絡合物的離解,所以在隨后的陽極掃描中鐵絡合物可能表現(xiàn)出差異,從而不會產(chǎn)生相等強度的電流.這些結果暗示,除了醌基以外,DOM中還可能存在其他氧化還原活性基團,如多種氧化態(tài)的雜環(huán)原子結構(氮或硫)和金屬有機絡合基團.2.3古環(huán)境對電子供體的氧化還原dm的影響微生物Fe(Ⅲ)還原不但對鐵的生物地球化學循環(huán)產(chǎn)生影響,而且對其它的痕量元素和營養(yǎng)物質的分布及有機物的降解起著重要的作用.自然界中Fe(Ⅲ)多以不溶性鐵氧化物存在,使得微生物還原鐵氧化物的速率很慢.為了減輕微生物與鐵礦物直接接觸的需要,氧化還原介體(電子穿梭體)的存在就很有必要,如腐殖質及其模型物AQDS等.以難溶性水鐵礦(HFO)為電子受體,以乳酸鹽為電子供體,研究了DOM對菌株D14T還原HFO的影響,結果見圖5.從圖5可知,只有D14T和DOM作用,沒有外源電子供體,HFO有很少量的還原,可能是DOM中存在一些小分子物質(如有機酸、氨基酸)被D14T利用,與2.1結果一致.在D14T和乳酸鹽同時存在下,添加DOM有利于加速HFO還原,且隨反應時間的增加,促進作用越明顯,經(jīng)14d的反應,添加DOM處理的HFO的還原速率比不添加DOM(菌液+10mmol·L-1乳酸鹽)的高出51.2%.由以上實驗可知,DOM具有氧化還原活性,可以反復轉移電子,且在D14T還原HFO中起到明顯的促進作用,說明DOM可以從D14T獲得電子,然后將電子傳遞給不溶性的HFO,從而提高了電子的傳遞速率,起到氧化還原介體的作用.3d4t與乳酸鹽(1)污泥DOM可作為末端電子受體接受醌還原菌D14T呼吸鏈上的電子,從而轉變?yōu)檫€原態(tài)DOM,而還原態(tài)的DOM可作為電子供體轉移電子給Fe(Ⅲ).污泥DOM初始電子供給量為2.2～14μmol·g-1,在D14T和乳酸鹽的參與下,其潛在電子供給量顯著增加到253～347μ