cab反膠束中木素過氧化物酶lip不能表現(xiàn)活力的原因分析

cab反膠束中木素過氧化物酶lip不能表現(xiàn)活力的原因分析

膠蜀酶是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的跨學(xué)科交叉研究領(lǐng)域。主要研究反膠束酶的催化劑性能，探索其潛在應(yīng)用[1.4]。1983年，在一些白腐菌（如phan箭科）中發(fā)現(xiàn)了一種含有血液的過敏酶，它對天然高聚物素和小分子環(huán)境污染物的生物降解起到了重要作用[7.14]。因此，lip的誘導(dǎo)性能和機(jī)制研究對充分利用自然資源、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、水和土壤的生物修復(fù)和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。迄今為止，lip的研究主要集中在傳統(tǒng)的水介質(zhì)中[15.17]。近年來，人們研究了lip在反凝膠介質(zhì)中的催化劑性能，并對其用于多孔芳酸根分解的應(yīng)用潛力進(jìn)行了研究。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在含有乙醇的16烷基-甲基氧化物（ctag）的反聚束中，lip不能發(fā)揮任何作用，但液體介質(zhì)中的高濃度ctag對lip的誘導(dǎo)活動沒有影響。為了闡明乙醇的作用，我們研究了不同碳鏈長度的乙醇對lip酶催化性能的影響。1實(shí)驗(yàn)部分1.1月桂醇聚氧乙烯醚引領(lǐng)下的生物基苯磺酸鈉aol島津UV240型紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)及其恒溫附件;HZS-H型恒溫水浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司).月桂醇聚氧乙烯醚(Brij30)、琥珀酸二辛酯磺酸鈉(AOT)購自Sigma公司;藜蘆醇(VA)購自Fluka公司,溴化十六烷基三甲銨(CTAB)、H2O2、異辛烷、環(huán)己烷、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、丁醇、戊醇、己醇、辛醇、正十二醇等均為國產(chǎn)分析純試劑,水為三蒸水.1.2反膠束體系的合成在小錐形瓶中加入一定體積的異辛烷或環(huán)己烷,按所需表面活性劑濃度稱取一定質(zhì)量的某表面活性劑于錐形瓶中,再加入一定體積某pH緩沖液(緩沖液的體積等于按給定水與表面活性劑摩爾比(ω0)計算所得的總水體積減去酶液和用于引發(fā)酶促反應(yīng)所需的H2O2水溶液體積),CTAB體系還需要加入一定量的短碳鏈醇作助表面活性劑,振蕩片刻,即形成澄清、透明的反膠束體系.1.3由木素氧化酶lip生產(chǎn)產(chǎn)木素過氧化物酶的菌種、培養(yǎng)條件及其酶的分離純化同文獻(xiàn).1.4反膠束總體積l-1h2-1h2l-1h2-1h21e評分的測定直接稱取一定量的底物藜蘆醇(VA)溶于上述反膠束體系中,再依據(jù)所需濃度加入一定量的直鏈醇(文中物質(zhì)濃度都是基于反膠束總體積的值),搖勻后,取一定體積于石英比色皿中,加入一定體積LiP酶液并搖勻在某溫度下預(yù)熱2min后,以10mmol·L-1H2O2溶液引發(fā),在分光光度計上記錄310nm處吸光度(A)隨時間(t)變化的曲線.2ctab反膠束與高效醇作用的關(guān)系藜蘆醇是木素過氧化物酶的最適底物,文中所示LiP的催化活力均為其在過氧化氫存在下對VA的氧化初速率.VA的氧化產(chǎn)物為藜蘆醛,它在310nm處有較強(qiáng)的光吸收.以往研究中,我們對常見的不同類型的表面活性劑形成的膠束和反膠束中木素過氧化物酶(LiP)的催化性能進(jìn)行了較為深入系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)LiP的催化活力不僅與表面活性劑的類型有關(guān),還與表面活性劑聚集體結(jié)構(gòu)有關(guān)(另文報道).在水介質(zhì)中CTAB對LiP的催化活性影響不是很大,然而在CTAB/醇/異辛烷/水反膠束中LiP卻表現(xiàn)不出活力.我們曾嘗試改變體系的ω0,水相pH,CTAB濃度和醇的種類(n=4,5,6,8,12,n為直鏈醇的鏈長),結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)LiP在其中有明顯活力.為了揭示其中醇的影響(CTAB必須在有助表面活性劑的條件下才能形成反膠束,短碳鏈的醇是常用的一類助表面活性劑),本文就不同碳鏈長度的醇對LiP酶催化性能的影響進(jìn)行了研究.由于CTAB反膠束體系中醇濃度較高,且碳原子數(shù)大于4的直鏈醇在水中的溶解度又很小,為此采用了LiP可在其中顯示催化活力的CTAB正膠束、AOT反膠束和Brij30反膠束作介質(zhì),通過研究這些介質(zhì)中不同鏈長的醇對LiP催化活力的影響,來探討CTAB反膠束中木素過氧化物酶(LiP)不能表現(xiàn)活力的原因.表1和表2給出了在CTAB正膠束和AOT反膠束中不同鏈長和濃度醇存在下LiP的催化活力.由表1,2可見,無論是在CTAB正膠束還是AOT反膠束中,低濃度的醇對LiP都表現(xiàn)出一定的激活作用,而高濃度的醇對LiP卻都表現(xiàn)出一定的抑制作用.在CTAB正膠束中由于醇溶解度的限制,沒有得到使LiP完全失活的醇濃度.在AOT反膠束中除丁醇外(需超過1200mmol·L-1)其余醇都在500mmol·L-1以下便可使LiP酶完全喪失活力.由于形成澄清、透明的CTAB反膠束所需助表面活性劑醇的濃度通常超過500mmol·L-1,因此,推測高濃度醇對LiP的失活作用是LiP在CTAB反膠束中不能體現(xiàn)活力的主要原因.在上述研究中雖考慮了表面活性劑聚集體結(jié)構(gòu)的影響,但沒有考慮表面活性劑電荷及反膠束大小的影響,為進(jìn)一步認(rèn)識直鏈醇對反膠束體系中木素過氧化物酶催化活性的影響,以戊醇為代表,本文還研究了由Brij30構(gòu)成的不同大小的非離子反膠束(ω0=3,4和10)中,不同濃度的戊醇對LiP酶活力的影響,結(jié)果見表3.由表3可見,在ω0=10的Brij30反膠束中,500mmol·L-1的戊醇便可使LiP酶活力完全喪失;即高濃度直鏈醇對木素過氧化物酶有失活作用.這一結(jié)果進(jìn)一步支持了前述關(guān)于“高濃度直鏈醇對木素過氧化物酶的失活作用是LiP在CTAB反膠束中不能體現(xiàn)活力的主要原因”的推論.從表3還可以看出,不同含水量下LiP催化活力隨戊醇含量變化的趨勢都表現(xiàn)為先下降后上升再下降.這一點(diǎn)與在CTAB正膠束和AOT反膠束中觀測到的現(xiàn)象有所不同.由表1和表2可見,不同鏈長的醇對LiP的影響都表現(xiàn)為先升后降;低濃度的醇對LiP有一定的激活作用,且醇的激活作用隨碳鏈長度的增加逐漸減小.這很可能與表面活性劑電性質(zhì)、頭基大小及醇在聚集體結(jié)構(gòu)中的定位有關(guān).對離子型表面活性劑形成的膠束,少量醇的加入(主要增溶在表面活性劑膜相中),不但降低了表面活性劑頭基間的相互作用,也降低了頭基與酶蛋白表面的相互作用.水介質(zhì)中表面活性劑對LiP催化活力影響研究表明,CTAB和AOT都是LiP的抑制劑,尤其是AOT水介質(zhì)中很少量的AOT便可使LiP酶完全喪失活力.因此,頭基與酶蛋白表面作用的減弱導(dǎo)致LiP活力有所回升(LiP是一類較為特殊的過氧化物酶,結(jié)合位點(diǎn)與催化位點(diǎn)在其蛋白的表面).由于長鏈醇的羥基更接近于表面活性劑膜相的內(nèi)界面,故相同醇濃度下,隨著醇碳鏈的增加,醇與LiP的相互作用(失活)加大,從而表現(xiàn)出低濃度下長碳鏈醇的表觀激活作用要小一點(diǎn).水介質(zhì)中,非離子表面活性劑對LiP酶活力的影響總體來說不大(少量的Brij30對LiP還有點(diǎn)激活作用).對Brij30反膠束,在給定水含量下,少量戊醇的加入降低了Brij30與LiP間的氫鍵(穩(wěn)定)作用,從而表現(xiàn)出LiP活力有所降低.由于戊醇羥基主要落在Brij30分子的親水部分與疏水部分連接區(qū)域,繼續(xù)少量增加戊醇導(dǎo)致了Brij30反膠束界面曲率增大,從而降低了醇與酶蛋白接觸機(jī)會,故酶活力又有所回升.上述理由也可以用來解釋不同含水量下戊醇對LiP活力的影響.相同戊醇濃度下,ω0越大,界面曲率越小,戊醇頭基越容易與酶蛋白接觸使酶失活.3ctab反膠束中l(wèi)ip的催化活性不同表面活性劑聚集