不同生理狀態(tài)黃顙魚免疫活性內(nèi)分泌細(xì)胞的定位

不同生理狀態(tài)黃顙魚免疫活性內(nèi)分泌細(xì)胞的定位

促性腺激素釋放激素（gnrh）是一種十醇結(jié)構(gòu)的神經(jīng)激素，gnrh細(xì)胞主要分布在腦癱中。GnRH以神經(jīng)分泌方式從神經(jīng)末梢釋出,分泌到垂體門靜脈中的GnRH可對垂體促性腺激素的合成和釋放起重要的調(diào)節(jié)作用。隨著對這一領(lǐng)域研究的深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在下丘腦以外的許多器官中也存在GnRH,而且不同器官中的GnRH具有不同的功能。有研究者用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在大鼠的胃腸中發(fā)現(xiàn)存在GnRH免疫活性細(xì)胞和神經(jīng);在大鼠頜下腺的上皮細(xì)胞等處見到GnRH的免疫活性陽性反應(yīng);在大鼠的胸腺內(nèi)發(fā)現(xiàn)GnRH免疫活性陽性細(xì)胞的存在。GnRH是通過特異膜受體的介導(dǎo)發(fā)揮生理作用,生殖軸的各個(gè)器官都含有GnRHR。上世紀(jì)70年代末相繼在生殖軸之外的組織中發(fā)現(xiàn)有GnRHR的存在,如在大鼠的胃腸上皮細(xì)胞中存在著較強(qiáng)的GnRHR免疫陽性反應(yīng),這些研究結(jié)果證明了GnRH功能的多樣性。目前未見有關(guān)對魚類消化系統(tǒng)中GnRH及其受體進(jìn)行同步研究的報(bào)道。本研究可為組織學(xué)、生理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)等相關(guān)學(xué)科提供新的資料,可為神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)、腦-腸肽等學(xué)術(shù)理論及GnRH功能的多樣性提供新的形態(tài)學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1booin氏液切片黃顙魚和鲇成魚各10尾,購自武漢市大東門水產(chǎn)市場。清水中暫養(yǎng)24h,鮮活時(shí)解剖,依次取出食道、賁門、胃底、幽門、前腸、中腸、后腸、胰臟等部位,立即投入Bouin氏液中,固定12h后修塊整理,再投入Bouin氏液中固定12h,共固定24h,梯度酒精脫水,二甲苯透明,低度石蠟(52~54℃)包埋,切片6μm,明膠貼片,40℃烘片24h,入4℃冰箱中備用。1.2試劑抗血清和主要試劑見表1。1.3模型的制備(1)以上切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精下行入水后,于3%H2O2/PBS溶液于室溫中處理5min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。(2)正常山羊血清(1∶50)在37℃下孵育20min,以封閉非特異性第二抗體的結(jié)合。(3)滴加該抗原的抗血清(一抗),在4℃下孵育過夜后。(4)加1∶100生物素化二抗在37℃孵育20min。(5)加1∶100SABC復(fù)合物37℃孵育20min。(6)用0.05%的DAB在含有0.01%H2O2的0.05mol·L-1Tris-HCL緩沖液(pH7.6)中顯色。以上所有過程均在濕盒中進(jìn)行,并保持pH為7.3。陰性對照片以上述切片的連續(xù)切片用正常血清取代一抗進(jìn)行孵育,其它各步驟均與上述步驟同步進(jìn)行。免疫染色完成后,脫水、透明、封片,于Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察,彩色顯微攝影。2gnrh及其受體的免疫活性本實(shí)驗(yàn)中的陽性反應(yīng)在細(xì)胞質(zhì)上表達(dá)呈棕色,胞核呈陰性不著色;由于底物的原因,背景呈淺黃色。所有的對照片各部位均呈陰性反應(yīng)。GnRH及其受體的免疫活性陽性細(xì)胞(簡稱GnRH細(xì)胞和GnRHR細(xì)胞)在黃顙魚和鲇2種魚的消化系統(tǒng)中各部位的分布及密度見表2。其中鲇從食道至腸道各段均有GnRH及其受體的免疫活性陽性反應(yīng);在黃顙魚的消化道中,除了食道和賁門之外的胃腸道中都有GnRH及其受體的免疫活性陽性反應(yīng)(表1)。在鲇的食道和賁門上皮細(xì)胞中可見到GnRH細(xì)胞的存在(圖版-1)。而GnRH細(xì)胞在黃顙魚和鲇胃底、幽門的上皮(圖版-2)、胃底腺中(圖版-3)有較高的分布密度;在腸和腸固有膜中亦可見到GnRH細(xì)胞的分布(圖版-4,5);2種魚的胰腺中均可見到GnRH細(xì)胞的稀疏分布,陽性反應(yīng)強(qiáng)度不大(圖版-6)。GnRHR細(xì)胞廣泛存在于鲇的消化道中(表2),特別是在食道復(fù)層上皮中分布較密(圖版-7)。在鲇和黃顙魚2種魚的胃上皮和胃腺中GnRHR細(xì)胞的分布密度也很大(圖版-8,9),腸上皮間的陽性細(xì)胞則分布稀疏(圖版-10),同時(shí)見到有GnRH受體免疫活性陽性反應(yīng)在鲇胰島中所表現(xiàn)(圖版-11),腸肌間神經(jīng)叢及副交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亦呈GnRH受體免疫活性陽性(圖版-12)。3gnrh對克氏原螯蝦的調(diào)節(jié)作用大量研究證明,胃腸道粘膜中存在許多散在分布的內(nèi)分泌細(xì)胞,可以分泌多種激素,已被認(rèn)為是體內(nèi)最大、最復(fù)雜的內(nèi)分泌器官。在淡水魚類的胃腸胰中已鑒別出13種免疫活性內(nèi)分泌細(xì)胞。在哺乳動物消化系統(tǒng)中也有了關(guān)于GnRH鑒別和定位研究的報(bào)道,但魚類消化系統(tǒng)中是否存在GnRH還未見報(bào)道。本研究觀察到GnRH免疫活性內(nèi)分泌細(xì)胞在鲇和黃顙魚消化系統(tǒng)中的分布,從形態(tài)學(xué)上證實(shí)魚類的胃腸胰也是魚體內(nèi)GnRH來源的重要場所之一。GnRH可作為神經(jīng)激素、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì),而分布在不同器官中的GnRH作用也不同。視網(wǎng)膜GnRH作為一種神經(jīng)遞質(zhì)能增強(qiáng)節(jié)細(xì)胞對顏色刺激的敏感性;胎盤絨毛GnRH調(diào)節(jié)絨毛膜促性腺激素等多種絨毛激素的釋放;廣泛分布在哺乳動物胃腸胰中GnRH對消化生理起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究不但見到GnRH的免疫活性陽性,同時(shí)還觀察到GnRH受體的免疫活性陽性反應(yīng),證實(shí)了GnRH對魚類的消化生理起著重要的調(diào)節(jié)作用。GnRH在體內(nèi)的重要功能是由GnRH受體介導(dǎo)的,要知道GnRH是否對某一組織細(xì)胞有功能意義,必須要先了解這種組織細(xì)胞是否含有GnRH的受體。下丘腦-垂體-性腺軸的各個(gè)器官都含有GnRH受體,GnRH在其受體的介導(dǎo)下對生殖器官發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。而在鲇和黃顙魚的腦、垂體和卵巢中也觀察到了GnRH受體的免疫活性陽性反應(yīng),GnRH在魚類生殖生理活動中所起的重要作用已眾所周知。最新的研究報(bào)道了哺乳動物消化系統(tǒng)中存在GnRH受體及GnRH-mRNA,但是魚類的消化系統(tǒng)中是否具有GnRH受體,GnRH對魚類消化系統(tǒng)是否有功能意義均未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對2種魚的研究發(fā)現(xiàn)在食道上皮、食道腺、胃上皮、胃腺、腸上皮、腸固有膜、胰腺、胰島和腸肌間神經(jīng)叢等部位均存在GnRH受體的免疫活性陽性反應(yīng);它們在2種魚消化系統(tǒng)中的分布部位有一定的差異,這可能與食性的不同有關(guān),但是在每種魚中GnRH及其受體的分布模式具有很高的相似性,說明GnRH能以自分泌或旁分泌的方式,對上述器官的功能進(jìn)行局部調(diào)節(jié)。魚類的食道有對食物的選擇和分泌粘液以助食物吞咽的功能,胃小凹上皮的主要功能是分泌粘液,胃底腺壁細(xì)胞主要產(chǎn)生胃酸。腸上皮細(xì)胞主要參與胃腸道蠕動的調(diào)節(jié),胰主要分泌消化酶等;本研究證實(shí)以上部位都有GnRH受體的分布,提示魚類GnRH對