酵母單雜交實驗步驟總結

..1pBait-AbAi載體的構建〔酵母報道子的構建〕注：酵母報道子〔pBait-AbAi〕包含目的順式作用元件的一個或多個拷貝，且插入到pAbAi載體AbAir報告基因的上游。大量研究說明最有效的構建應包含目的DNA三個以上的首尾連接的拷貝。首尾連接的拷貝產(chǎn)生方式很多，但對于長度小于20bp的調(diào)控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途徑。設計并合成包含目的序列的兩條反向平行的寡核苷酸序列，且兩端加上與pAbAi載體酶切產(chǎn)物一致的粘性末端〔建議合成一個目的序列的突變序列作為對照，以排除可能的假陽性〕。用TEbuffer溶解寡核苷酸至終濃度100mol/L。將正向鏈和反向鏈按照1:1的比例混合〔退火后的雙鏈寡核苷酸最大濃度為50mol/L〕。95C保溫30s，去除二級構造。72C保溫2min，37C保溫2min，25C保溫2min。注：緩慢退火，有助于雙鏈寡核苷酸的形成。冰上放置。退火后的產(chǎn)物可貯存在-20C冰箱備用。酶切1LpAbAi載體，用凝膠回收純化或柱純化的方式純化酶切產(chǎn)物。注：回收前，可用瓊脂糖凝膠檢測是否酶切完全。將退火后的寡核苷酸稀釋100倍至終濃度為0.5mol/L。在連接反響管中參加如下成分：pAbAi載體〔50ng/L〕1.0annealedoligonucleotide〔0.5mol/L〕1.010×T4DNAligasebuffer1.5BSA〔10mg/mL〕0.5Nuclease-freeH2O10.5T4DNAligase〔400U/L〕0.5總體積15L注：如果有必要，可用1Lnuclease-freeH2O代替寡核苷酸作為陰性對照。將反響體系室溫放置連接3h，轉化Ecoli，采用常規(guī)方法檢測陽性克隆。注：可用酶切或測序進展檢測。2質粒轉化酵母細胞，生成Bait-Reporter酵母菌株〔圖〕圖3Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意圖用BstBI或者BbsI酶切2LpBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi質粒，使其在URA3基因處斷開，純化酶切產(chǎn)物。按MatchmakerYeastTransformationSystem2的步驟用1l酶切后的質粒轉化Y1HGold酵母。稀釋每個轉化體系至1/10、1/100、1/1000，分別取每個稀釋物均勻涂于SD/-Ura瓊脂平板上。3d后挑取5個單克隆，用MatchmakerInsertCheckPCRMix1進展PCR檢測陽性克隆，用Y1HGold的單克隆做陰性對照。在PCR管中加25lPCR-gradeH2O。用干凈的槍頭輕輕接觸酵母單克隆，以獲得非常少量的酵母細胞。將槍頭伸進PCR-gradeH2O中攪拌，使酵母細胞散開。注：切忌挑取整個酵母單克隆，因為細胞過多會阻止PCR反響的進展。如果參加細胞后水變渾濁，證明參加了過多的酵母細胞。向每個管中參加25lMatchmakerInsertCheckPCRMix，混勻，離心。每個PCR管中現(xiàn)已含有如下反響物：MatchmakerInsertCheckPCRMix25lH2O/yeast25l總體積50l按下述程序進展PCR反響；95C1min98C10s55C30s30cycles68C2min取5lPCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。注：引物與AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因組結合，擴增片段長約1.4kb。圖4PCR檢測pBait-AbAi的插入情況正確的PCR檢測結果應是：陽性對照：1.4kb陰性對照：無條帶誘餌菌株：1.35kb+insertsize分別挑取PCR檢測呈陽性的誘餌克隆和p53-AbAi對照克隆，在SD/-Ura平板上劃線培養(yǎng)。30C孵育3d后，將平板置于4C保存，即為新構建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]對照菌株。經(jīng)過長期放置后，挑取單克隆在YPDA液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用1mL預冷培養(yǎng)基〔100ml滅菌的YPDA與50ml滅菌的75%甘油混合〕重懸菌體，速凍后與-70C保存。3檢測誘餌菌株AbAr基因的表達在不存在捕獲物的情況下，由于克隆到pAbAi載體中的誘餌序列不同，誘餌菌株報告基因的本底表達水平也不一樣。例如：p53-AbAi對照的最低aureobasidinA抑制濃度為100ng/ml。注：酵母單雜交實驗成功的前提是沒有源轉錄因子能夠與目的序列結合或者結合能力非常弱。因此在進展文庫篩選之前，檢測所構建的誘餌菌株AbAr基因的表達情況十分重要。所以需要進展實驗以確定進展文庫篩選時抑制誘餌菌株報告基因本底表達所需的AbA濃度。分別挑取誘餌克隆和對照克隆，用0.9%NaCl重懸細胞，調(diào)節(jié)A600到0.002〔大約2000個細胞/100l〕。在下述培養(yǎng)基上分別涂布100l重懸后的菌液，30C培養(yǎng)2-3d。SD/-UraSD/-UrawithAbA〔100ng/mL〕SD/-UrawithAbA〔150ng/mL〕SD/-UrawithAbA〔200ng/mL〕預期結果如下所示：表1AbAr基因預期本底表達結果[AbA]/〔ng/mL〕Y1HGold[p53-AbAi]克隆數(shù)Y1HGold[pBait-AbAi]克隆數(shù)0約2000約20001000Baitdependent1500Baitdependent2000Baitdependent在進展文庫篩選時，使用AbA的濃度應為最低抑制濃度，或使用比最低抑制濃度稍高的AbA濃度〔高約50-100ng/mL〕，以徹底抑制誘餌菌株的生長。注：如果200ng/mLAbA不能抑制本底表達，可以嘗試提高AbA濃度至500-1000ng/mL。然而，在不存在捕獲物的情況下，如果1000ng/mL的AbA濃度仍無法抑制AbAr基因的表達，那么很可能存在能夠識別并與目的序列結合的源調(diào)控因子，因而該目的序列無法用來進展酵母單雜交篩選。4文庫cDNA的合成提取試材總RNA，進展反轉錄合成cDNA。合成的cDNA末端具有與pGADT7-Rec一樣的酶切位點。cDNA第一鏈的合成=1\*GB3①準備高質量的polyA和/或總RNA，用humanplacentapolyA+RNA作為陽性對照。注：RNA的質量決定文庫的質量，RNA應為所要研究的特定時期和特定組織的RNA。=2\*GB3②在微量離心管中參加如下反響物：RNA模板〔0.025-1.0gpolyA和/或0.10-2.0CDSIII〔oligo-dT〕orCDSIII/6〔random〕引物1.0DeionizedH2O〔使總體積到達4.0l〕1-2總體積4.0在另外一支管中參加對照cDNA反響物，即RNA使用1l〔1g〕controlpolyA+RNA。=3\*GB3③72C孵育2min。=4\*GB3④冰上放置2min，輕輕混勻，立即參加步驟=5\*GB3⑤中的試劑。=5\*GB3⑤每一個反響參加如下試劑，輕輕混勻離心。5×first-strandbuffer2.0DTT〔100mmol/L〕1.0dNTPmixture〔10mmol/L〕1.0SMARTM-MLVRT1.0總體積5.0注：步驟=5\*GB3⑤中的試劑可在步驟=2\*GB3②之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始關鍵步驟，變性后的RNA/引物mix冰上放置的時間不應超過2min。=6\*GB3⑥如果用的是CDSIII/6隨機引物，25-30C保溫10min。如果用的是CDSIII引物，省略此步，進展步驟=7\*GB3⑦。=7\*GB3⑦42C保溫10min。=8\*GB3⑧參加1lSMARTIIIoligo，充分混合，42C保溫1h。=9\*GB3⑨75C保溫10min終止第一鏈的合成。=10\*GB3⑩降至室溫，參加1lRNaseH〔2U〕。1137C保溫20min。12cDNA第一鏈合成產(chǎn)物應于-20C保存，可用3個月?！?〕longdistancePCR〔LD-PCR〕合成cDNA第二鏈根據(jù)合成cDNA第一鏈時使用的RNA量，下表給出了進展LD-PCR時最正確的熱循環(huán)數(shù)。使用的熱循環(huán)數(shù)越少，非特異性PCR產(chǎn)物越少。表2RNA量與最正確熱循環(huán)數(shù)總RNA/gPolyA+RNA/g循環(huán)數(shù)1.0-2.00.5-1.015-200.5-1.00.25-0.520-220.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26=1\*GB2⑴LD-PCR反響混合物中參加如下物質〔每個樣品做2個100l體系，對照做1個100l體系〕：First-strandcDNA〔fromprotocolA〕2lDeionizedH2O70l10×advantage2PCRbuffer10l50×dNTPmix2l5’RACE引物2l3’RACE引物2lMeltingsolution10l50×advantage2polymerasemix2l總體積100l=2\*GB2⑵按照以下程序進展PCR反響：1個循環(huán)95C30sX個循環(huán)95C10s68C6min1個循環(huán)68C5min=3\*GB2⑶取7lPCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測，檢測時使用1kbDNAladder。使用CHROMASPIN+TE-400柱純化dscDNA=1\*GB2⑴為每一個要純化的cDNA樣品準備一個CHROMASPIN+TE-400柱。=2\*GB2⑵將純化柱翻轉幾次，充分懸浮gelmatrix。=3\*GB2⑶移去柱的頂蓋和底蓋，將柱放入2ml收集管中。=4\*GB2⑷將柱放入離心機，700g離心5min以消除平衡緩沖液，棄掉收集管中的液體。=5\*GB2⑸將柱放入新的收集管中，把cDNA加到gelmatrix的中央，切勿使樣品沿柱的壁流下。注：加到邊上易使樣品沿柱壁流下，易混有小片段cDNA。=6\*GB2⑹700g離心5min，純化的cDNA收集到管中。=7\*GB2⑺將兩個純化的cDNA樣品合并到一管，測量體積。=8\*GB2⑻參加1/10體積3mol/L醋酸鈉〔pH5.3〕，混勻。=9\*GB2⑼參加2.5倍體積無水乙醇。=10\*GB2⑽-20C冰凍1h。=11\*GB2⑾室溫，14000r/min離心20min。=12\*GB2⑿小心棄去上清液，切勿碰到沉淀。=13\*GB2⒀14000r/min瞬時離心，去除殘留上清液。=14\*GB2⒁沉淀于空氣中枯燥10min。注：一般枯燥至無乙醇味，不可過度枯燥，否那么很難溶解。=15\*GB2⒂用20l滅菌去離子水溶解沉淀，此cDNA可用來進展同源重組構建文庫。純化后的cDNA用1%的瓊脂糖電泳檢測。5構建并篩選酵母單雜交文庫〔cDNA融合表達文庫的構建及篩選〕構建并在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上檢測Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。注：AbA的濃度根據(jù)構建誘餌載體時轉入酵母抑制本底表達時的濃度而定。按SMARTtechnology步驟合成dscDNA，其濃度為2-5g/20L。用YeastTransformationSystem2的方法轉化酵母，在轉化體系中參加如下物質：=1\*GB3①cDNA文庫轉化Y1HGold[Bait/AbAi]菌株20lSMART-amplifieddscDNA〔2-5g〕6lpGADT7-Rec，〔SmaI-linearized〕〔3g〕=2\*GB3②Y1HGold[53/AbAi]的轉化5lp53fragment〔125g〕2lpGADT7-Rec，〔SmaI-linearized〕〔1g〕將轉化體系分別稀釋至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100l涂100mm平板。文庫轉化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，對照p53轉化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。將剩余的所有文庫轉化混合物〔約15ml〕涂在150mmSD/-Leu/AbA平板上，每板涂150l。倒置培養(yǎng)3-5d。3-5d后，通過統(tǒng)計SD/-Leu100mm平板上的克隆數(shù)目來計算篩選的克隆數(shù)。注：所篩選的克隆數(shù)至少應該到達1百萬，否那么會降低篩選到目的產(chǎn)物的可能性。篩選的克隆數(shù)=[cfu/mlonSD/-Leu]×[dilutionfactor]×[resuspensionvolume〔15ml〕]例如：resuspensionvolume=15mlPlatingvolume=100l250coloniesgrewonthe1/100dilutiononSD/-LeuplatesThenumberofclonesscreened=250cfu/0.1ml×100×15ml=3.75million預期結果陽性對照試驗：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培養(yǎng)基上的克隆數(shù)相近。文庫篩選試驗：根據(jù)SD/-Leu平板上的克隆數(shù)計算所篩選的克隆數(shù)，其結果應大于1百萬且SD/-Leu/AbA平板上的克隆數(shù)遠遠少于1百萬，陽性克隆數(shù)目取決于誘餌序列。6陽性克隆的鑒定及cDNA質粒的別離陽性克隆重新劃線培養(yǎng)，進展表型確認=1\*GB3①將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重新劃線，產(chǎn)生新的單克隆。=2\*GB3②2-4d后，選擇能夠正常生長的克隆進展后續(xù)分析。酵母克隆PCR消除重復克隆=1\*GB3①用MatchmakerInsertCheckPCRMix2〔Cat.No.630497〕進展PCR，對插入到pGADT7載體中的cDNA片段進展擴增。PCR管中參加以下反響物：MatchmakerInsertCheckPCRMix25lH2O/Yeast25l總體積50l=2\*GB3②按下述程序進展PCR反響：94C1min98C10s68C3min=3\*GB3③PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進展電泳分析。產(chǎn)物不是單一的條帶很正常，這說明在同一酵母細胞不存在一種捕獲載體注：為了確認大小相近的條帶是否是同一種插入片段，用AluI或HaeIII或者其它常用的限制性切酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進展電泳分析。=4\*GB3④如果大量的克隆含有同一插入片段，那么另取50個克隆進展PCR分析。=5\*GB3⑤為了快速驗證克隆，PCR產(chǎn)物可經(jīng)過純化后用T7引物測序。陽性cDNA質粒的別離獲取=1\*GB3①酵母中文庫質粒的分開。與轉化的大腸桿菌不同，轉化的酵母細胞可以含多種相關質粒，這就意味著陽性克隆里不只含有能激活AbAr報告基因的質粒，還可能含有一種或多種不表達相互作用蛋白的cDNA質粒。如果不事先將非互作質粒分開出去而直接通過轉化大腸桿菌獲取質粒，那么很有可能獲取到非相互作用的質粒。為了增加獲取陽性克隆捕獲質粒的幾率，可以將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重復涂布2-3次，每次都挑取單一的克隆進展下一步涂布。=2\*GB3②從酵母中獲取陽性cDNA質粒為了鑒定陽性互作相關的基因，用EasyYe