3種陸生植物葉片浸提液對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)及光合生理的影響

3種陸生植物葉片浸提液對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)及光合生理的影響

向舒，陳雯雯，沈盎綠（上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海201306）東海原甲藻（Prorocentrumdonghaiense）赤潮在福建、浙江沿海常有發(fā)生，該藻已經(jīng)成為了我國(guó)東海海域內(nèi)引發(fā)赤潮次數(shù)最多、累計(jì)面積最大的肇事甲藻［1］。東海原甲藻赤潮期間造成水體缺氧，降低中華哲水蚤（Calanussinicus）種群豐度從而影響漁業(yè)資源［2－3］。網(wǎng)箱養(yǎng)殖是海水增養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要方式之一，赤潮的暴發(fā)會(huì)對(duì)網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)生嚴(yán)重影響［4］。因此，如何有效防治近岸水產(chǎn)養(yǎng)殖海域有毒有害赤潮成為目前我國(guó)赤潮災(zāi)害防治的熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一。植物化感作用因簡(jiǎn)單易操作、對(duì)環(huán)境壓力小且無(wú)二次污染、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)，正逐漸成為當(dāng)下藻華生物防治的重要手段之一。早期大多涉及陸生植物抑制淡水藻類，其中紫玉蘭（Yulanialiliiflora）、女貞子（Ligustrilucidi）、石榴（Punicagranatum）和銀杏（Ginkgobiloba）等陸生木本植物分泌的化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）和絲狀藻（Cladophorasp.）等淡水藻類有較好的抑制效果［5－8］。但是在海洋赤潮藻類抑制方面，目前大多數(shù)研究聚焦在稻麥稈、玉米（Zeamays）和加拿大一枝黃花（Solidagocanadensis）等陸生草本植物［9－10］。鹽角草（Salicorniaeuropaea）、互花米草（Spartinaalterniflora）［11－13］及紅樹(shù)林植物秋茄葉（Kandeliacandel）、木欖（Bruguieragymnorhiza）和海芒果（Cerberamanghas）等濕地植物［14－15］也具有化感抑藻作用。此外，少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，陸生木本植物對(duì)海洋藻類具有較好的抑制作用，比如托里桉（Eucalyptustarelliana）粉和杉木（Cunninghamialanceolata）粉能夠有效去除水體中的米氏凱倫藻（Kareniamikiotoi）或東海原甲藻等海洋藻類［16－17］。常見(jiàn)木本植物香樟（Cinnamomumcamphora）、夾竹桃（Neriumindicum）和銀杏雖被證明其落葉浸出液中化感物質(zhì)可有效抑制黃絲藻（Tribonemabombycinum）、銅綠微囊藻等淡水藻類的生長(zhǎng)，并導(dǎo)致其光合生理發(fā)生顯著變化［8，18］，但作為良好的化感物質(zhì)候選者，這幾種植物對(duì)赤潮生物東海原甲藻的抑藻效果卻未見(jiàn)報(bào)道?；诿}沖-振幅-調(diào)制的葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量技術(shù)（pulse-amplitude-modulation，PAM），因快速且不傷害植物本身而被廣泛用于測(cè)量植物光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的生理變化，可提供最大光化學(xué)量子效率（Fv/Fm）、有效光化學(xué)量子效率（Fv′/Fm′）、最大相對(duì)電子傳遞效率（rETRmax）和光能轉(zhuǎn)化效率（α）等有效光合參數(shù)［19］。在植物化感抑藻方面的研究中，這些參數(shù)被廣泛應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)荔枝（Litchichinensis）、銀杏和互花米草等植物中存在的化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻、東海原甲藻和絲狀藻等微藻的光合參數(shù)具有顯著抑制作用［8，13］。借鑒森林防火隔離帶原理，當(dāng)沿海養(yǎng)殖區(qū)面臨赤潮威脅時(shí)，在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)用陸生植物葉片粉末構(gòu)筑一道赤潮隔離帶，可實(shí)現(xiàn)保護(hù)海水養(yǎng)殖區(qū)的目的。本研究在前期篩選有效陸生植物的基礎(chǔ)上，選擇具有較好化感作用的香樟、夾竹桃和銀杏葉片作為研究對(duì)象，探究其葉片浸提液對(duì)東海原甲藻的抑制效果；在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用PAM測(cè)定3種植物葉片浸提液對(duì)東海原甲藻細(xì)胞的Fv′/Fm′、rETRmax和α等光合作用參數(shù)，從而綜合評(píng)價(jià)香樟、夾竹桃和銀杏這3種植物葉片浸提液對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)及光系統(tǒng)PSⅡ的調(diào)控作用，為東海原甲藻生物防控提供依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料香樟、夾竹桃和銀杏葉片于2019年10—11月收集自上海市上海海洋大學(xué)校園內(nèi)。將清洗干凈的材料置于60℃烘箱中烘干，粉碎過(guò)篩（100目），常溫密封保持備用。東海原甲藻（GY-H40）購(gòu)自上海光語(yǔ)生物科技有限公司，藻類培養(yǎng)基采用f/2培養(yǎng)基。培養(yǎng)基所用海水采自浙江省舟山市漳州灣近岸（29°54′56″N、122°25′14″E），海水經(jīng)過(guò)孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾，然后經(jīng)過(guò)121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。藻類培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強(qiáng)度大約為20μmol·m－2·s－1，光暗比為14h∶10h。藻類培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均按照以上條件在新苗智能型光照培養(yǎng)箱（GZX-250BSH-Ⅲ，上海）進(jìn)行。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1植物葉片浸提液的制備稱取50.0g植物粉末，加入500mL滅菌海水，60℃水浴鍋中水溶2h后取上清液，然后重新加入滅菌海水，多次重復(fù)上述操作至上清液無(wú)色。上清液再經(jīng)0.22μm的濾膜過(guò)濾，除去顆粒雜質(zhì)和微生物，得到最終實(shí)驗(yàn)浸提母液，質(zhì)量濃度為50.0g·L－1。1.2.23種植物葉片浸提液抑藻實(shí)驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，香樟和夾竹桃實(shí)驗(yàn)中每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)質(zhì)量濃度梯度為0.1、0.5、1.0和3.0g·L－1的試驗(yàn)組。銀杏實(shí)驗(yàn)中每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)質(zhì)量濃度梯度為0.1、0.5、1.0、3.0和5.0g·L－1的試驗(yàn)組。將處于指數(shù)增長(zhǎng)期的東海原甲藻接種于100mL錐形瓶中，同時(shí)添加植物葉片浸提液，接種后的總體積為50mL。香樟、夾竹桃和銀杏植物葉片浸提液處理組中東海原甲藻的起始藻密度均為1.1×104個(gè)·mL－1。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)組，培養(yǎng)條件與1.1相同。實(shí)驗(yàn)周期為96h，每天光周期2h后取樣一次，進(jìn)行藻細(xì)胞密度和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。1.2.3東海原甲藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定通過(guò)浮游植物分類熒光儀（PHYTO-PAMED，Walz公司，德國(guó)）測(cè)定東海原甲藻的Fv′/Fm′和rETR，參數(shù)測(cè)定時(shí)光化學(xué)設(shè)置參見(jiàn)文獻(xiàn)［20］。rETR和光照強(qiáng)度（I）之間關(guān)系按照EILERS和PEETERS［21］的公式進(jìn)行擬合，F(xiàn)v′/Fm′、rETRmax及α計(jì)算公式參見(jiàn)文獻(xiàn)［20］。本實(shí)驗(yàn)光照強(qiáng)度設(shè)置為1、32、64、164、264、364、464、564、664、764μmolphotons·m－2·s－1共10個(gè)梯度，每個(gè)光強(qiáng)下照射時(shí)間為20s。1.3數(shù)據(jù)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，Shapiro-Wilk和Levene檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布和方差齊性。在數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布以及方差相等的前提下采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異顯著的情況下（P＜0.05表示差異顯著）采用Tukey’s方法進(jìn)行多重比較。所有圖表采用Origin2015軟件進(jìn)行繪制。藻類抑制率計(jì)算方法參照文獻(xiàn)［10］。96h-EC50的計(jì)算采用GraphPadPrism7.0軟件［22］。2結(jié)果與分析2.13種植物葉片浸提液對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)的影響由圖1可知，0.1g·L－1香樟浸提液處理96h時(shí)間內(nèi)，東海原甲藻藻細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；1.0g·L－1和3.0g·L－1浸提液在48h對(duì)東海原甲藻的藻密度具有顯著的抑制作用（P＜0.05），96h時(shí)藻密度的抑制率分別為57.6%和100.0%。鑒于對(duì)東海原甲藻的抑制率已達(dá)100%，所以更高濃度（＞3.0g·L－1）試驗(yàn)組在圖1中不再顯示。經(jīng)計(jì)算，香樟浸提液對(duì)東海原甲藻的96h-EC50值為0.84g·L－1。圖1不同梯度濃度香樟葉片浸提液對(duì)東海原甲藻藻密度的影響Fig.1EffectsofCinnamomumcamphoraleafextractconcentrationgradientonalgaedensityofProrocentrumdonghaiense由圖2可知，夾竹桃浸提液對(duì)東海原甲藻的抑制效果趨勢(shì)基本一致，0.1g·L－1浸提液處理后東海原甲藻藻細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；1.0g·L－1夾竹桃浸提液處理96h后東海原甲藻密度與對(duì)照組相比下降較為明顯，抑制率為38.1%（P＜0.05）。高濃度3.0g·L－1浸提液作用下，藻密度在48h時(shí)出現(xiàn)急劇下跌，96h藻密度抑制率為100%（P＜0.05）。經(jīng)計(jì)算，夾竹桃浸提液對(duì)東海原甲藻的96h-EC50值為1.30g·L－1。圖2不同梯度濃度夾竹桃葉片浸提液對(duì)東海原甲藻藻密度的影響Fig.2EffectsofNeriumindicumleafextractconcentrationgradientonalgaedensityofP.donghaiense由圖3可知，0.1g·L－1銀杏浸提液處理下東海原甲藻藻密度與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），0.5g·L－1和1.0g·L－1浸提液處理72h時(shí)藻細(xì)胞還能輕微生長(zhǎng)。3.0g·L－1和5.0g·L－1浸提液處理后東海原甲藻的藻密度48h時(shí)出現(xiàn)顯著下降，96h時(shí)抑制率達(dá)到74.9%和88.7%（P＜0.05）。經(jīng)計(jì)算，銀杏浸提液對(duì)東海原甲藻的96h-EC50值為1.74g·L－1。圖3不同梯度濃度銀杏葉片浸提液對(duì)東海原甲藻藻密度的影響Fig.3EffectsofGinkgobilobaleafextractconcentrationgradientonalgaedensityofP.donghaiense2.23種植物葉片浸提液對(duì)東海原甲藻PSⅡ的影響2.2.1對(duì)東海原甲藻Fv′/Fm′的影響如圖4-A所示，0.1g·L－1香樟葉片浸提液處理96h后東海原甲藻Fv′/Fm′值與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。而0.5g·L－1和1.0g·L－1葉片浸提液處理96h后藻類Fv′/Fm′抑制率分別為19.4%和29.9%（P＜0.05）。3.0g·L－1浸提液處理下藻細(xì)胞的Fv′/Fm′值急劇下降，72h時(shí)藻類Fv′/Fm′抑制率為100.0%（P＜0.05）。如圖4-B所示，0.1g·L－1夾竹桃葉片浸提液處理96h內(nèi)藻細(xì)胞Fv′/Fm′值與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。0.5g·L－1和1.0g·L－1葉片浸提液處理后藻細(xì)胞Fv′/Fm′值出現(xiàn)小幅度下降，96h后藻類Fv′/Fm′抑制率分別為11.9%和19.4%（P＜0.05）。3.0g·L－1浸提液處理下藻細(xì)胞的Fv′/Fm′值劇烈下降，96h后藻類Fv′/Fm′抑制率為97.0%（P＜0.05）。由圖4-C所示，濃度低于1.0g·L－1銀杏葉片浸提液處理時(shí)，藻細(xì)胞Fv′/Fm′值與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。3.0g·L－1葉片浸提液處理96h后藻類Fv′/Fm′抑制率為34.9%，5.0g·L－1葉片浸提液作用24h后藻類Fv′/Fm′抑制率為50.8%，96h后藻類Fv′/Fm′抑制率達(dá)88.9%（P＜0.05）。圖4不同梯度濃度香樟（A）、夾竹桃（B）、銀杏（C）葉片浸提液對(duì)東海原甲藻有效光化學(xué)量子效率（Fv′/Fm′）值的影響Fig.4EffectsofC.camphora（A），N.indicum（B）andG.biloba（C）leafextractconcentrationgradientoneffectivephotochemicalefficiency（Fv′/Fm′）ofP.donghaiense2.2.2對(duì)東海原甲藻PSⅡ光合活性參數(shù)的影響通過(guò)測(cè)量藻細(xì)胞的快速光曲線得到香樟葉片浸提液對(duì)東海原甲藻PSⅡ光合活性參數(shù)（圖5）。0.1、0.5g·L－1和1.0g·L－1香樟葉片浸提液處理72h內(nèi)，東海原甲藻的α值與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），浸提液處理96h后，0.1g·L－1和0.5g·L－1組雖然顯著低于對(duì)照組和1.0g·L－1組，但是絕對(duì)值相差不大。藻細(xì)胞rETRmax值和Ik值在實(shí)驗(yàn)期間的變化幅度則大于α值，處理組濃度越高，兩者的數(shù)值越低（P＜0.05）。高濃度3.0g·L－1浸提液處理下，藻細(xì)胞α值、rETRmax值和Ik值從24h開(kāi)始就顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），并且在72h時(shí)表現(xiàn)出急劇降低，96h后藻類的PSⅡ光合活性參數(shù)均處于極低狀態(tài)（P＜0.05）。圖5不同梯度濃度香樟葉片浸提液對(duì)東海原甲藻光能轉(zhuǎn)化效率α（A）、最大相對(duì)電子效率rETRmax（B）及光飽和系數(shù)Ik（C）的影響Fig.5EffectsofC.camphoraleafextractconcentrationgradientonthephotosynthesisefficiencyα（A），relativemaximalelectrontransportratesrETRmax（B）andlightsaturationcoefficientIk（C）ofP.donghaiense如圖6所示，夾竹桃葉片浸提液在低濃度范圍內(nèi)（0.1、0.5g·L－1和1.0g·L－1）對(duì)東海原甲藻PSⅡ光合活性參數(shù)的影響與香樟葉片浸提液對(duì)其的影響趨勢(shì)基本一致，東海原甲藻α值差異不顯著（P＞0.05）。3.0g·L－1處理組對(duì)東海原甲藻α值、rETRmax值和Ik值都在24h出現(xiàn)驟降，但在96h后卻有所回升，各個(gè)參數(shù)的藻類抑制率分別為57.4%、94.0%和70.1%（P＜0.05），均未達(dá)到完全抑制。圖6不同梯度濃度夾竹桃葉片浸提液對(duì)東海原甲藻光能轉(zhuǎn)化效率α（A）、最大相對(duì)電子效率rETRmax（B）及光飽和系Ik（C）的影響Fig.6EffectsofN.indicumleafextractconcentrationgradientonthephotosynthesisefficiencyα（A），relativemaximalelectrontransportratesrETRmax（B）andlightsaturationcoefficientIk（C）ofP.donghaiense如圖7所示，0.1、0.5g·L－1和1.0g·L－1銀杏葉片浸提液處理下，東海原甲藻的α值、rETRmax值和Ik值在72h內(nèi)都與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），浸提液處理96h后0.1、0.5和1.0g·L－1組雖然與對(duì)照組有差異，但是絕對(duì)值也相差不大。3.0g·L－1浸提液作用下，96h內(nèi)藻細(xì)胞α值出現(xiàn)小幅度下降（P＜0.05），rETRmax值和Ik值與對(duì)照組相比有小幅波動(dòng)（P＞0.05）。5.0g·L－1浸提液處理后，東海原甲藻α值、rETRmax值和Ik值在實(shí)驗(yàn)期間不斷下降，96h后各個(gè)參數(shù)的藻類抑制率分別達(dá)到88.9%、96.1%和62.2%（P＜0.05）。圖7不同梯度濃度銀杏葉片浸提液對(duì)東海原甲藻光能轉(zhuǎn)化效率α（A）、最大相對(duì)電子效率rETRmax（B）及光飽和系Ik（C）的影響Fig.7EffectsofG.bilobaleafextractconcentrationgradientonthephotosynthesisefficiencyα（A），relativemaximalelectrontransportratesrETRmax（B）andlightsaturationcoefficientIk（C）ofP.donghaiense3討論3.1不同植物提取物對(duì)藻類抑制效果的影響近年來(lái)赤潮發(fā)生的頻率和危害不斷上升，自2000年以來(lái)東海海域經(jīng)常暴發(fā)大規(guī)模東海原甲藻赤潮［23］，所以篩選有效的生物防治方法控制東海原甲藻赤潮成為十分迫切的事情。由于陸生植物種類多、來(lái)源廣、化感物質(zhì)更豐富，所以在抑藻劑原材料選擇上，陸生植物提供了更多選擇［24］。香樟、夾竹桃及銀杏是我國(guó)常見(jiàn)的綠化樹(shù)種，其樹(shù)形高大、枝葉豐滿，利用其落葉化感作用抑制藻類生長(zhǎng)，不僅可以有效防控赤潮的發(fā)生，也能實(shí)現(xiàn)落葉的廢物利用。在本研究中，東海原甲藻在對(duì)照組中一直處于指數(shù)增長(zhǎng)期，但在3種植物浸提液處理組中藻類生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，發(fā)現(xiàn)香樟的抑制效果最為顯著，其次是夾竹桃，銀杏效果最差。香樟［25］、夾竹桃［26］及銀杏［27］水提液均含有豐富的黃酮類化合物，這類化合物對(duì)藻類生長(zhǎng)具有抑制作用。3種植物浸提液抑藻程度差異化的主要原因可能是黃酮化合物種類不同，不同種類黃酮類化合物中羥基個(gè)數(shù)不同，羥基個(gè)數(shù)越多抑藻效果越好；其次黃酮分子結(jié)構(gòu)中引入3位親水基團(tuán)、A環(huán)5位帶負(fù)電氫鍵供體基團(tuán)、B環(huán)4’位親水氫鍵供體基團(tuán)及3’、4’位帶負(fù)電基團(tuán)有利于化合物抑藻效果的增加，反之，A環(huán)6、7位引入帶負(fù)電羥基供體基團(tuán)或B環(huán)2’、3’、5’及6’位引入氫鍵供體基團(tuán)能削弱黃酮化合物的抑藻效果；此外黃酮類化合物分子極性越大、通透性越高及疏水性越強(qiáng)，其抑藻活性也更高［28］。除黃酮類化合物之外，木脂素類化合物是樟屬植物中的一類主要化學(xué)成分，這類物質(zhì)被降解產(chǎn)生氧化類多酚可能抑制藻類生長(zhǎng)［29］。夾竹桃葉片中特有的夾竹桃苷類［26］、銀杏葉片中大量的有機(jī)酸類［27］等化合物也是導(dǎo)致抑藻活性差異的重要原因。這3種植物有效物質(zhì)成分的組成和含量存在差異，后續(xù)將通過(guò)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀等儀器定量分析3種植物葉片水提液的各種有效成分的組成和含量，為后期分析相關(guān)抑藻作用機(jī)制提供更為精確的靶點(diǎn)。3.2植物化感作用對(duì)藻類光合作用的影響葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量技術(shù)是測(cè)量植物光合作用最經(jīng)典的手段，因快速、靈敏、無(wú)損傷而被用于赤潮藻類光合機(jī)制的研究，利用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可以有效監(jiān)控藻細(xì)胞PSⅡ的生理狀態(tài)，光合系統(tǒng)PSⅡ的Fv′/Fm′值、α值和rETRmax值取決于電子傳輸鏈的容量或Calvin循環(huán)的限制［30－31］。在研究植物化感物質(zhì)對(duì)藻類作用機(jī)理中，PSⅡ是被認(rèn)為最敏感的位點(diǎn)之一，特別是對(duì)電子傳遞鏈某一區(qū)段表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。本研究中香樟、夾竹桃和銀杏植物葉片中都含有豐富的黃酮類物質(zhì)，3種植物浸提液高濃度試驗(yàn)組會(huì)導(dǎo)致東海原甲藻Fv′/Fm′值、α值和rETRmax值顯著降低。相似地，黃皓旻［28］發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)木犀草素會(huì)導(dǎo)致銅綠微囊藻的Fv/Fm值、α值和rETRmax值顯著下降，破壞銅綠微囊藻的光合作用從而抑制其生長(zhǎng)。李超等［32］發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)槲皮素能脅迫球形棕囊藻（Phaeocystisglobsa）的光合系統(tǒng)，導(dǎo)致球形棕囊藻的Fv/Fm、Fv′/Fm′值、α值和rETRmax值呈不同程度降低，對(duì)球形棕囊藻光合作