絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證結(jié)合動物模型的建立及通絡(luò)方藥的干預(yù)作用

絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證結(jié)合動物模型的建立及通絡(luò)方藥的干預(yù)作用

中醫(yī)認(rèn)為，血液在血管中的運(yùn)行需要向下運(yùn)動。氣虛血虛不能鍛煉或氣虛血瘀不能導(dǎo)致血液運(yùn)動障礙和血管病變。絡(luò)氣虛滯(stagnancyofcollateral-Qiinadeficiencycondition,SCQDC)是脈絡(luò)病變由功能性病變向器質(zhì)性病變發(fā)展的早期階段,與血管內(nèi)皮功能障礙具有內(nèi)在一致性,這對于血管病變防治的基礎(chǔ)研究具有重要的指導(dǎo)意義。然而此方面的研究剛剛起步,尚缺乏公認(rèn)的動物模型。本研究以絡(luò)病學(xué)理論為指導(dǎo),基于400例血管內(nèi)皮功能障礙患者原始資料數(shù)據(jù)分析建立的“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”絡(luò)氣虛滯血管內(nèi)皮功能障礙診斷標(biāo)準(zhǔn),以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動物,采用高同型半胱氨酸血癥誘發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙為基礎(chǔ)病理模型,疊加“基礎(chǔ)進(jìn)食+強(qiáng)迫負(fù)重游泳”誘發(fā)氣虛證候,制作絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙動物模型,以絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙證候診斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù),分別從一般狀況、血管內(nèi)皮功能變化等方面對所建動物模型進(jìn)行綜合評價,同時應(yīng)用單味益氣中藥人參、益氣活血的雙參(人參+丹參)、通絡(luò)復(fù)方通心絡(luò)(人參、水蛭、全蝎、赤芍等)三種通絡(luò)方藥進(jìn)行干預(yù),以期為該方面的研究提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)平臺。1免疫組織化學(xué)游泳缸(100cm×70cm×80cm);LEICARM2125切片機(jī)(中國上海Leica公司),BL-420E+生物信號采集系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),YH-4型張力換能器(北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所);SP免疫組化檢測試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司),抗ACE抗體(美國Santacruz公司),抗AT1、ET-1抗體(武漢博士德生物有限公司),抗eNOS抗體(北京中山金橋生物有限公司),氯化乙酰膽堿、苯腎上腺素(Sigma公司);蛋氨酸(河北省農(nóng)科院提供,由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心制作成3%的高蛋氨酸飼料,純度99.9%,批號B7NE-05-0007-MC02),人參注射液、雙參注射液(由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供),通心絡(luò)超微粉(由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供,批號20050530)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1實(shí)驗(yàn)動物及動物健康雄性Wistar大鼠180只,體質(zhì)量220~250g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號SCXK2002-0003。隨機(jī)分為對照組、同型半胱氨酸(HCY)組、絡(luò)氣虛滯組、人參組、雙參組、通心絡(luò)組,每組30只。2.2靜態(tài)被放入量HCY組喂飼3%高蛋氨酸飼料(不限食),不限飲水。絡(luò)氣虛滯組于喂飼高蛋氨酸飼料4周后,于基礎(chǔ)進(jìn)食(每只成年大鼠于靜息狀態(tài)下的采食量,約相當(dāng)于自身體質(zhì)量的5%)條件下力竭游泳。每只造模大鼠在25~27℃水溫的自制游泳缸中,每日強(qiáng)迫負(fù)重(按每只造模大鼠自身體質(zhì)量的5%計算)游泳,采取2次游泳法,前后相差10min,游泳至力竭為止,以最大限度耗竭動物體力(力竭標(biāo)準(zhǔn):游泳范圍逐漸縮小,動作明顯失調(diào)、慌張,鼻部在水面上下浮動,頭部沒入水面下10s不能上浮)連續(xù)游泳訓(xùn)練14d。2.3通心絡(luò)組內(nèi)灌胃給藥方法人參注射液組、雙參注射液組于喂飼高蛋氨酸飼料開始,即分別給予1ml/100g體質(zhì)量腹腔注射;通心絡(luò)組按1ml/100g體質(zhì)量灌胃給藥;對照組和HCY組給予等量的0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)灌胃,于每天上午9~10點(diǎn)進(jìn)行,每周給藥6次,周日休息。3測試指標(biāo)和方法3.1一般情況下的監(jiān)控每日觀察各組大鼠的一般情況(皮毛、鼻色、尾色、大便等)。記錄絡(luò)氣虛滯組大鼠的力竭游泳時間;每3d記錄動物體質(zhì)量一次。3.2小鼠肉的急性毒性試驗(yàn),記錄在肌肉疲勞于末次給藥30min后,將每只大鼠(HCY組除外)放在自制爬桿架上,使其肌肉處于靜力緊張狀態(tài),記錄小鼠由于肌肉疲勞時從爬桿架上跌落的時間,第3次跌落時終止實(shí)驗(yàn),累計記錄3次跌落時間為爬桿時間。3.3對血管內(nèi)外功能的生物化學(xué)指標(biāo)的檢測3.3.1edta-na230l和抑肽酶20l的抗凝活性測定各組大鼠于造模結(jié)束后,禁食7h,10%水合氯醛麻醉下頸動脈插管采集血液標(biāo)本5ml,其中2ml注入含有10%的EDTA-Na230μl和抑肽酶40μl的無菌抗凝試管中(冰浴中保存),混勻,4℃,3000r/min,離心10min,分離血漿備檢;另外3ml注入含有消炎痛-EDTA-Na2液0.2ml的無菌抗凝試管中(冰浴中保存),4℃,3500r/min,離心15min,分離血漿備檢;同法采取2ml血液,分離血清備檢。3.3.2u3000血管環(huán)拉合各組于末次給藥后30min,隨機(jī)取出3只大鼠,斷頭處死,迅速分離胸主動脈,冰鹽水沖凈殘留的血液,并迅速放入盛有冷Krebs液的蠟盤中,并持續(xù)通入95%O2與5%CO2的混合氣體,并將血管修切成3~4mm寬的2個主動脈環(huán),分離后用2個不銹鋼針輕輕穿過血管環(huán),垂直懸掛于盛有10mlKrebs液的浴槽中,一端固定于浴槽底部,另一端連接張力傳感器,與BL-420E+生物信號采集系統(tǒng)相連。溫度保持在37℃左右,并持續(xù)通入上述混合氣體。在30min內(nèi)將血管環(huán)拉置滿張力2g,在2g基礎(chǔ)張力下平衡1h,期間每隔15min換液1次。加入10-3mol/L苯腎上腺素(PE),待收縮反應(yīng)曲線至平臺期,利用Krebs液沖洗3次,使其回落至基礎(chǔ)張力,確認(rèn)其反應(yīng)性穩(wěn)定后,開始實(shí)驗(yàn)。再次重新加入10-3mol/L苯腎上腺素,待收縮反應(yīng)曲線至平臺期,再加入10-3mol/L乙酰膽堿(ACh),觀察對ACh的舒張反應(yīng)變化,記錄反應(yīng)曲線,結(jié)果以對ACh舒張值占PE最大收縮值的百分比表示。血管環(huán)舒張率(%)=PE收縮峰值?ACh舒張峰值PE收縮峰值?基礎(chǔ)張力值×100％ΡE收縮峰值-ACh舒張峰值ΡE收縮峰值-基礎(chǔ)張力值×100％3.3.3在各組大鼠動脈組織中，奧登斯塔、at1和enos的發(fā)現(xiàn)用免疫組化的方法檢測。4統(tǒng)計分析方法所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包,多個樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(One-WayANOVA),多個樣本均數(shù)間的兩兩比較用最小顯著差法(leastsignificantdifference,LSD),若方差不齊則采用Satterthwaite-t’檢驗(yàn)行兩兩比較,以P<0.05作為判定差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。5結(jié)果5.1組動物體質(zhì)量比較絡(luò)氣虛滯組自施加力竭游泳因素后的第13天,游泳時間最長,此后則呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。與對照組比較,絡(luò)氣虛滯組動物體質(zhì)量顯著下降,且出現(xiàn)明顯的精神萎靡,眼瞼下垂,反應(yīng)不靈敏;皮膚松弛,皮下少有脂肪,甚至抓之觸骨,背部毛發(fā)少光澤,出現(xiàn)縮肩拱背;尾、鼻淡紅;大便軟有形。各治療組一般情況略有改善。另外,與絡(luò)氣虛滯組比較,通心絡(luò)組大鼠爬桿時間明顯延長(P<0.05)。5.2組大鼠血清hcy、絡(luò)透氣性、背景的比較結(jié)果見表1。與對照組比較△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;與HCY組比較▲P<0.05;與絡(luò)氣虛滯組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001與對照組比較*P<0.05,***P<0.001;與絡(luò)氣虛滯組比較#P<0.05,##P<0.01;與人參組比較▲▲P<0.015.3各組大鼠胸動脈疾病的內(nèi)在依賴率為ach結(jié)果見表2。5.4各組大鼠、et-1、at1和enos免疫組的化學(xué)結(jié)果的比較結(jié)果見表3。6血管內(nèi)皮損傷對絡(luò)氣虛滯血管內(nèi)皮功能障礙患者調(diào)查的研究資料顯示,該類患者一方面內(nèi)皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)等血管活性物質(zhì)分泌失常,肱動脈介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能(FMD)下降;另一方面表現(xiàn)出乏力、神疲、氣短、懶言、脈弱等征象。據(jù)此,本研究選用健康成年Wistar大鼠,以高蛋氨酸飲食誘發(fā)高同型半胱氨酸血癥致血管內(nèi)皮功能障礙為病理損傷模型,根據(jù)《素問·刺志》的“谷盛氣盛,谷虛氣虛”,《靈樞·五味篇》的“谷不入半日則氣衰,一日則氣少矣”;《素問·舉痛論》的“勞則喘息汗出,外出皆越,故氣耗矣”。采用疊加基礎(chǔ)進(jìn)食復(fù)合強(qiáng)迫負(fù)重游泳誘發(fā)氣虛證候的方法,建立絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙動物模型。結(jié)果顯示,模型大鼠出現(xiàn)了精神萎靡,眼瞼下垂,反應(yīng)遲鈍,毛發(fā)枯槁,體質(zhì)量顯著下降,皮下少有脂肪,甚至抓之觸骨,鼻尾顏色蒼白,大便不成形或稀溏等現(xiàn)象。與絡(luò)氣虛滯血管內(nèi)皮功能障礙患者的證候特征基本吻合。另外,絡(luò)氣虛滯組大鼠耐力降低,力竭游泳時間呈現(xiàn)非線性波動,波動的幅度逐漸減小且呈現(xiàn)下降趨勢,與程志清等的研究結(jié)果一致。從另外一個角度佐證了絡(luò)氣虛滯大鼠的證候?qū)W表現(xiàn)與臨床患者證候表現(xiàn)的一致性。ET-1是目前已知縮血管作用最強(qiáng)的血管活性物質(zhì)之一,通常以極低的生理濃度存在于體內(nèi),但在血管內(nèi)皮損傷的情況下,ET-1的合成、釋放增加可達(dá)數(shù)倍或數(shù)10倍。同時在ET-1和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)之間還存在著相互增強(qiáng)作用。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,HCY組大鼠血漿中AngⅡ水平明顯升高(P<0.01),絡(luò)氣虛滯組血漿AngⅡ、ET-1水平亦顯著增高(P<0.001,P<0.05),且AngⅡ含量顯著高于HCY組(P<0.05)。提示本實(shí)驗(yàn)所建模型可能存在有兩者之間的協(xié)同作用,從而使得血管內(nèi)皮的損傷進(jìn)一步加劇。血栓素A2(TXA2)是活性很高的血小板致凝劑,并具有強(qiáng)烈收縮血管平滑肌的作用。前列環(huán)素I2(PGI2)的生理作用與TXA2相拮抗,可使血小板聚集,舒張血管平滑肌,維持血管內(nèi)皮的完整性,表明血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整和功能的正常與PGI2/TXA2平衡的維持關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示,絡(luò)氣虛滯組TXA2含量較對照組進(jìn)一步顯著升高(P<0.001),而PGI2含量則近一步下降(P<0.01),同時作為經(jīng)典的內(nèi)皮依賴性舒張因子NO水平與PGI2的變化趨勢一致,這與絡(luò)氣虛滯血管內(nèi)皮功能障礙患者的臨床研究結(jié)果相一致。上述結(jié)果提示,在HCY致血管內(nèi)皮損傷的反應(yīng)中已經(jīng)有ET-1、TXA2、PGI2、NO等血管活性物質(zhì)分泌的異常,而氣虛證候的存在可從某種程度上進(jìn)一步加重縮血管與舒血管活性物質(zhì)之間的平衡紊亂,另外,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,絡(luò)氣虛滯大鼠動脈組織eNOS陽性信號較對照組和HCY組明顯減弱,ACE、AT1、ET-1陽性信號明顯增強(qiáng),進(jìn)一步從關(guān)鍵酶和受體水平為上述推測提供了佐證。另外,本實(shí)驗(yàn)利用體外血管環(huán)技術(shù)對各組胸主動脈血管對ACh的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示,絡(luò)氣虛滯組血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)顯著弱于對照組(P<0.05,P<0.001),提示所建動物模型在血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)方面與臨床患者具有一定的一致性。本實(shí)驗(yàn)給予三種通絡(luò)方藥干預(yù)后,動物的一般情況出現(xiàn)了不同程度的改善,人參、雙參可顯著降低血漿中AngⅡ、ET-1水平,升高NO含量。通心絡(luò)除了顯著降低血漿AngⅡ、ET-1水平,升高NO含量外,還可使血漿中TXA2、PGI2水平分別呈現(xiàn)出下降和上升趨勢。同時三種通絡(luò)方藥還可從不同程度上減弱ACE、AT1、ET-1陽性信號,增強(qiáng)eNOS陽性信號表達(dá),此作用以通心絡(luò)組最顯著。提示成分明確的單味益氣中藥可在一定程度上改善血管內(nèi)皮功能,并提示此時血管病變正處于功能性病變階段;另一方面提示通絡(luò)復(fù)方在改善血管內(nèi)皮功能方面在一定程度上優(yōu)于單味中藥。綜上所述,本研究以絡(luò)氣虛滯血管內(nèi)皮功能障礙患者的臨床研究資料為背景,結(jié)合“饑則損氣”、“勞則氣耗”的中醫(yī)病機(jī)理論,首先以高蛋氨酸飲食誘發(fā)高同型半胱氨酸血癥致血管內(nèi)皮功能障礙為病理基礎(chǔ)模型,采用“基礎(chǔ)進(jìn)食+強(qiáng)迫負(fù)重游泳”的方法誘發(fā)氣虛證候,所建模型表現(xiàn)出的精神萎靡、眼瞼下垂、反應(yīng)遲鈍、體質(zhì)量下降等一般狀況與臨床患者絡(luò)氣