水稻紋枯病的發(fā)生與防治

水稻紋枯病的發(fā)生與防治

水稻萎縮是中國(guó)水稻事務(wù)之一，近年來(lái)已成為水稻的三大主要疾病之一。該病害導(dǎo)致水稻結(jié)實(shí)率下降,千粒重降低,水稻減產(chǎn)最高可達(dá)50%。20世紀(jì)70年代以來(lái),隨著氮肥施用量的增加,矮稈、多蘗和密植等栽培技術(shù)的推廣,水稻紋枯病的發(fā)展蔓延加快,危害也日益嚴(yán)重。20世紀(jì)90年代中期對(duì)我國(guó)南方稻區(qū)的調(diào)查結(jié)果表明,水稻紋枯病的發(fā)病面積是稻瘟病的2.07倍,造成的損失是稻瘟病的1.97倍,在我國(guó)南方稻區(qū)的許多地方紋枯病已成為水稻的第一大病害。引起水稻紋枯病的病原菌有性態(tài)為擔(dān)子菌亞門亡革菌屬瓜亡革菌[Thanatephoruscucumeris(Frank)Domk)],無(wú)性態(tài)為半知菌亞門絲核菌屬立枯絲核菌(Rhizoctoniasolanikühn)。自然條件下一般只有無(wú)性世代。立枯絲核菌是一種廣寄主、強(qiáng)腐生性的真菌。該菌通常以菌絲和菌核的形態(tài)習(xí)居于土壤,能侵染多種作物,在人工接種條件下可侵染43科263種植物,除引起水稻紋枯病外,還侵染玉米、大豆、花生、甘蔗、棉花、馬鈴薯等,引起禾谷類作物和經(jīng)濟(jì)作物的立枯、猝倒等癥狀。因此,不論連作還是輪作,都能使病原菌數(shù)量大量地積累,其主要的經(jīng)濟(jì)學(xué)意義受到植物病理學(xué)家和真菌分類學(xué)家的廣泛關(guān)注。本文簡(jiǎn)述了水稻立枯絲核菌的形態(tài)特征,概述了依據(jù)菌絲形態(tài)特征和融合群進(jìn)行分類的概況,闡述了部分分子生物學(xué)技術(shù)在水稻紋枯病菌遺傳多樣性研究中的應(yīng)用。1立枯絲核菌的特征自1851年DeCardolle首次報(bào)道絲核菌屬(Rhizoctonia)以來(lái),其后的100多年間,Duggar等又對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行補(bǔ)充描述,隨之發(fā)展到該屬有近100多種對(duì)其形態(tài)的描述。1969年,Parmeter和Whitney在總結(jié)絲核菌的形態(tài)特征的基礎(chǔ)上,正式提出立枯絲核菌種的概念,并得到世界大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。目前立枯絲核菌的特征描述為:(1)菌絲直徑較大,淺褐色至深褐色,生長(zhǎng)迅速。在遠(yuǎn)基的菌絲隔膜附近發(fā)生分枝,分枝角度變化大,開(kāi)始近直角,以后為銳角;(2)分枝的菌絲在發(fā)生點(diǎn)縊縮;(3)分枝點(diǎn)附近形成一隔膜;(4)產(chǎn)生念珠狀細(xì)胞,常稱作桶形細(xì)胞或厚垣孢子;這些細(xì)胞成鏈生長(zhǎng)聚集成團(tuán),因而有時(shí)被稱為分生孢子座,(5)形成結(jié)構(gòu)近乎均一的菌核,但形態(tài)和大小不一;(6)寄主范圍廣,產(chǎn)生許多不同的癥狀,包括猝倒、地下器官的腐爛、下胚軸和莖葉的枯萎、果實(shí)和種子的腐爛;(7)有性階段屬擔(dān)子菌;(8)具有明顯的隔孔器;(9)旺盛生長(zhǎng)的菌絲細(xì)胞為多核。2對(duì)該屬真菌的分類由于絲核菌屬真菌不產(chǎn)生任何無(wú)性孢子,長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)該屬真菌的分類一直存在爭(zhēng)議。目前,對(duì)水稻立枯絲核菌分類的方法主要有依據(jù)形態(tài)特征和菌絲融合群兩種對(duì)其進(jìn)行分類。2.1細(xì)胞絲核菌種根據(jù)菌絲形態(tài)和營(yíng)養(yǎng)菌絲隔膜的結(jié)構(gòu),絲核菌可分成兩大類:子囊絲核菌和擔(dān)子絲核菌。根據(jù)絲核菌細(xì)胞核數(shù)目和菌絲大小,又可將其分成三個(gè)類群:(1)多核絲核菌(multinudeateRhizoctonia),每個(gè)菌絲細(xì)胞具有3個(gè)或更多細(xì)胞核,菌絲直徑為6~10μm,有性態(tài)屬亡革菌屬(ThanatephoruscucumerisFrank)Donk),無(wú)性態(tài)為立枯絲核菌屬(R.solani);(2)雙核絲核菌,每個(gè)細(xì)胞只有2個(gè)細(xì)胞核(極少1或3個(gè)),菌絲直徑4~7μm,有性態(tài)屬角擔(dān)菌屬(Ceratobasidium),無(wú)性態(tài)包括禾谷絲核菌屬(R.cerealis);(3)水稻絲核菌(R.oryzac)和玉蜀黍絲核菌(R.zeae),菌絲細(xì)胞為多核,有性態(tài)為waitea屬。2.2立枯絲核菌植物內(nèi)融合群水稻紋枯病病原立枯絲核菌種內(nèi)有明顯的分化現(xiàn)象,存在著不同的菌絲融合群。因此,菌絲融合群系統(tǒng)被認(rèn)為是立枯絲核菌最有用的分群方法。當(dāng)兩個(gè)絲核菌分離物配對(duì)培養(yǎng)時(shí),在光學(xué)顯微鏡下可觀察到菌絲并行生長(zhǎng)和交疊。如果兩菌菌絲能相互融合,可觀察到菌絲間的吸引、交疊處菌絲細(xì)胞壁破裂,原生質(zhì)體融合,便稱這兩個(gè)分離物為相同的融合群。如果兩菌菌絲不能融合,則兩菌菌絲即使相互交叉重疊,也不發(fā)生上述融合的現(xiàn)象,仍各自向原生長(zhǎng)方向繼續(xù)生長(zhǎng)。1937年,Sohultz首次提出立枯絲核菌菌絲融合群(Anastomosisgroup,AG)的概念。1969年,Parmeter等對(duì)來(lái)自北美,歐洲和澳大利亞的138株立枯絲核菌菌株進(jìn)行菌絲融合測(cè)定,建立了4個(gè)菌絲融合群,第一次系統(tǒng)提出作為立枯絲核菌種內(nèi)融合群分類法,其分群的可靠性大,得到普遍認(rèn)同和迅速發(fā)展。1984年,Ogoshi等利用菌絲融合技術(shù)將日本的立枯絲核菌分為5個(gè)融合群。此后,融合群的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于立枯絲核菌的分類中,立枯絲核菌是一個(gè)集合種的觀點(diǎn)被廣泛接受。迄今為止,國(guó)際上已確認(rèn)18個(gè)(AG-1-IA~AG-11和AG-BI)立枯絲核菌種內(nèi)菌絲融合群。其中包括AG1融合群被劃分為的3個(gè)亞群。李祥等對(duì)湖北省分離自44個(gè)地區(qū)的62株水稻紋枯病菌菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行融合測(cè)試,結(jié)果證明,供試菌株均屬于AG-1-IA。楊根華等從云南省8個(gè)地區(qū)的水稻紋枯病組織上分離病原菌株,經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)菌株配合測(cè)定,將劃分為3個(gè)融合群,分別為AG-1-IC,AG-1-II和AG-Bb。3立枯絲核菌群落間的遺傳多樣性遺傳多樣性是指種內(nèi)基因的變化,包括種內(nèi)顯著不同的種群間和同一種群內(nèi)的遺傳變異,也稱為基因多樣性。遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分,對(duì)遺傳多樣性的研究能提供基因間相互作用的全面信息,觀察到群體內(nèi)和群體間由于位點(diǎn)間的相互作用而引起的變異分化,在基礎(chǔ)理論、遺傳育種和物種進(jìn)化等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。由于菌絲融合群分類法不能提供立枯絲核菌融合群內(nèi)和融合群間的更多的遺傳多樣性和種群系統(tǒng)演化的信息。因此,隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的深入研究與應(yīng)用,國(guó)內(nèi)外已有許多研究者采用不同的生物學(xué)的方法對(duì)紋枯病遺傳多樣性進(jìn)行研究。3.1生物化學(xué)技術(shù)在水稻遺傳多樣性研究中的應(yīng)用3.1.1同工酶的分離和鑒定自Markert和Moller于1957年首次提出同工酶的概念和同工酶技術(shù)以來(lái),該技術(shù)得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。同工酶(isozyme)是指生物體內(nèi)催化相同反應(yīng)而分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的一組酶。以一類蛋白質(zhì)的形式存在于所有生物中,同一個(gè)體的不同組織,同一組織或同一細(xì)胞中,其同工酶都有差異。同工酶分析技術(shù)是通過(guò)電泳和組織化學(xué)方法進(jìn)行特異性染色分離出同工酶,并將其位置和活性直接以酶譜的形式表現(xiàn)于染色區(qū)帶上。同工酶變異豐富、酶帶間差異表現(xiàn)在同一基因位點(diǎn)的等位基因的差異,能穩(wěn)定遺傳,不受生物性狀表現(xiàn)的影響,是研究生物遺傳多樣性中較為可靠的遺傳標(biāo)記。楊根華等利用酯酶同工酶對(duì)云南省54株水稻紋枯病菌株進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)不同菌系間存在明顯差異,同一菌系下菌株間的基本譜帶相似。王守正等對(duì)12個(gè)絲核菌標(biāo)準(zhǔn)融合群進(jìn)行酯酶同工酶譜分析,結(jié)果表明,12個(gè)絲核菌標(biāo)準(zhǔn)融合群的酯酶同工酶譜各不相同。表現(xiàn)在酶帶數(shù)目和所處位置的不同,這進(jìn)一步說(shuō)明各個(gè)菌株間融合群分類和劃分的融合群完全一致,證明融合群分類的合理性。胡春錦等對(duì)25個(gè)水稻紋枯病菌株進(jìn)行酯酶同工酶分析,結(jié)果表明,25個(gè)菌株共分出12條譜帶,不同致病力的菌株間酯酶同工酶圖譜相似,主酶帶基本相同,只是在副酶帶上有數(shù)目及顏色深淺之分。3.1.2菌株內(nèi)的遺傳多樣性可溶性蛋白電泳圖譜早已成為微生物分類研究中廣泛采用的一種生化技術(shù)。該技術(shù)在對(duì)稻瘟病菌的生理小種間的特性、水稻立枯絲核菌種內(nèi)的遺傳多樣性方面都有一定的應(yīng)用。陳集雙等用聚丙烯酰胺等電聚焦電泳的方法,對(duì)立枯絲核菌的45株菌株(屬于AG-1~AG-5各融合群或亞群)進(jìn)行可溶性蛋白比較。結(jié)果表明,不同融合群或亞群的蛋白質(zhì)圖譜表現(xiàn)出顯著差異。胡春錦等對(duì)25株稻紋枯病菌進(jìn)行可溶性蛋白分析,結(jié)果表明,各菌圖譜條帶數(shù)不一致,出現(xiàn)多態(tài)性,菌株致病力強(qiáng)弱與譜帶數(shù)目成正比。3.2菌分子標(biāo)記的多樣性分子標(biāo)記直接以DNA的形式出現(xiàn),不受環(huán)境和其它因素的影響,不需要同位素,安全性好,較便宜和快速易行。目前在水稻紋枯病菌遺傳多樣性中應(yīng)用的分子標(biāo)記主要有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)[28,29,30,31,32,33]、間簡(jiǎn)單序列重復(fù)(intersimplesequencerepeat,ISSR)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPloymorphism,AFLP)等技術(shù)。3.2.1水稻紋枯病菌的遺傳多樣性及地理來(lái)源RAPD技術(shù)是由Williams和Welsh等于20世紀(jì)90年代初提出的,當(dāng)時(shí)主要用于遺傳圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性的檢測(cè)。其原理是用一系列短的隨機(jī)DNA序列(一般10bp)作為引物,在熱穩(wěn)定的Taq酶的作用下,對(duì)未知序列的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)EB(溴化乙錠)染色或放射性自顯影,來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,電泳所呈現(xiàn)的帶型反映了DNA分子的總體結(jié)構(gòu)特征。曹菊香等采用RAPD技術(shù)對(duì)來(lái)自我國(guó)南方6省(區(qū))的水稻紋枯病菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明,水稻紋枯病菌各菌株之間相似性最高可達(dá)86%,最低為55%,各菌株之間存在一定程度的遺傳分化,當(dāng)相似性系數(shù)在0.54左右時(shí),將所有供試菌株聚為6個(gè)類群。RAPD分組與供試菌株的地理來(lái)源呈明顯的相關(guān)性。胡春錦等對(duì)廣西的稻紋枯病菌進(jìn)行RAPD分析表明,不同菌株間存在明顯的致病力分化,菌株DNA水平上的差異與其可溶性蛋白分析反映的遺傳差異具有一定程度的一致性。肖勇等對(duì)四川省5區(qū)55個(gè)縣(市)水稻紋枯病菌進(jìn)行RAPD聚類分析顯示,在相似系數(shù)為0.941處,該55株菌株可聚為8類。趙長(zhǎng)江等為了解水稻紋枯病菌群體遺傳結(jié)構(gòu),對(duì)福建省三明、龍巖、福州三地區(qū)以及廣東、黑龍江和遼寧等省的35個(gè)水稻紋枯病菌菌株進(jìn)行了RAPD分析。結(jié)果表明,根據(jù)RAPD分析得出相異性系數(shù)矩陣中水稻紋枯病菌最大相異性可達(dá)0.52,最低為0.045,各菌株間的遺傳背景各不相同,存在一定的遺傳分化。聚類分析將其劃分為五類,水稻紋枯菌的多樣性與菌株的地理來(lái)源不完全相關(guān),但在相異系數(shù)為0.41左右時(shí),南方大部分紋枯菌可以與北方相區(qū)別。周而勛等對(duì)海南、福建、廣西、云南、湖南和廣東等我國(guó)南方6個(gè)代表性省(區(qū))的72個(gè)水稻紋枯病菌菌株進(jìn)行了RAPD聚類分析。結(jié)果表明,通過(guò)使用10個(gè)隨機(jī)引物對(duì)該病菌基因組DNA進(jìn)行PER擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳,共獲得210條DNA譜帶,其中5條為特征帶,205條為多態(tài)帶,條帶多態(tài)率為98%,在0.54左右的相似性系數(shù)水平,所有供試菌株被劃分為6個(gè)類群,所有來(lái)自同一省(區(qū))的菌株均聚類為同一類群或亞類群,供試菌株存在豐富的遺傳多樣性。3.2.2引物和分子標(biāo)記的構(gòu)建間簡(jiǎn)單序列重復(fù)(ISSR)是一種新型的分子標(biāo)記,是由Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記。用于ISSR-PCR擴(kuò)增的引物通常為16~18個(gè)堿基序列,由1~4個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)和幾個(gè)非重復(fù)的錨定堿基組成,從而保證了引物與基因組DNA中SSR的5’或3’末端結(jié)合,避免引物在基因組上滑動(dòng)、間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的ISSR區(qū)域的多個(gè)條帶通過(guò)聚丙烯酞胺凝膠電泳得以分辨,擴(kuò)增譜帶多為顯性表現(xiàn)。錨定引物的ISSR-PCR可以檢測(cè)基因組許多位點(diǎn)的差異。李挺丹等對(duì)采集自福建省9地區(qū)共100個(gè)水稻紋枯病菌,利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析,獲得了穩(wěn)定性高、多態(tài)性強(qiáng)、并且可區(qū)分各菌株的引物和分子標(biāo)記體系。結(jié)果表明,供試水稻紋枯病菌群體存在豐富的遺傳多樣性。3.2.3水稻紋枯病菌aflp擴(kuò)增和測(cè)序擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)由ZabeauM和VosP于1993年創(chuàng)建的一種分子標(biāo)記技術(shù)。其原理是基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶充分酶切后,將特定的人工雙鏈接頭連在片段兩端,形成帶接頭的特異片段,根據(jù)接頭序列和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,對(duì)特異性模版片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,最后根據(jù)凝膠上DNA指紋的特點(diǎn)進(jìn)行分析。范文艷等將采集黑龍江省13個(gè)水稻種植地區(qū)的29個(gè)水稻紋枯病菌菌株進(jìn)行致病力測(cè)定和AFLP分析。結(jié)果表明,9對(duì)AFLP引物對(duì)供試菌株擴(kuò)增出396條帶,其中多態(tài)性帶187條,占總擴(kuò)增帶數(shù)的47.22%。黑龍江省水稻紋枯病菌的遺傳距離變化在0.50~0.92之間,平均為0.71,群體遺傳多樣性較為豐富。非加權(quán)組平均法(UPGMA,一種聚類分析方法)將供試菌株分成4個(gè)AFLP聚類組群(I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),相同地理來(lái)源的菌株基本上聚集在同一組群內(nèi),表明AFLP類群劃分與菌株的地理來(lái)源有較強(qiáng)的相關(guān)性。黑龍江省水稻紋枯病菌致病性分化較為明顯,并且AFLP類群劃分與菌株的致病性鑒定之間存在一定相關(guān)性。4水稻紋枯病菌分類及多樣性的研究有待深入目前,水稻紋枯病菌依據(jù)融合群來(lái)分類的方法得到廣泛應(yīng)用,為抗病育種確定了方向,具有可靠性。研究表明,局部地區(qū)或特定的田塊內(nèi)出現(xiàn)的融合群數(shù)是有限的,同時(shí),作物也影響一定地區(qū)或田塊間的某一融合群。一個(gè)特定融合群主要引起一種作物的特定病害,這為針對(duì)性抗病育種明確了方向。然而,在確定其可靠性的同時(shí)也帶來(lái)一定的局限性。表現(xiàn)在:(1)分類界限模糊,靠目前已有的標(biāo)準(zhǔn)融合群菌株不能完全區(qū)分某些被測(cè)菌株,出現(xiàn)A