單鏈核酸適配體保護(hù)納米金凝聚溶液變藍(lán)的研究

單鏈核酸適配體保護(hù)納米金凝聚溶液變藍(lán)的研究

作為一種新型的環(huán)境污染物，其內(nèi)部干擾物質(zhì)（也稱為環(huán)境激素）可以在人體和動(dòng)物體內(nèi)積累，并發(fā)揮類似于雌激素的作用。即使數(shù)量較少，也會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)污染物的內(nèi)源性和內(nèi)源性失衡。作為一類重要的內(nèi)分泌干擾物,雌二醇、睪酮、己烯雌酚等類固醇激素被發(fā)現(xiàn)存在于自然界的水體以及工廠的排污水中。其中雌二醇作為一種天然雌激素,具有很強(qiáng)的雌激素效應(yīng),能夠通過食物鏈進(jìn)入動(dòng)物和人體,可誘發(fā)雄性生殖系統(tǒng)畸形生長和功能異常,此外還可誘發(fā)腫瘤等。因此研究建立環(huán)境污水中雌二醇的檢測(cè)方法對(duì)于保護(hù)環(huán)境和保障人體健康具有重要意義。傳統(tǒng)的雌二醇檢測(cè)方法主要借助HPLC或GC-MS等分析儀器,可以準(zhǔn)確靈敏地檢出樣品中的雌二醇,但該方法分析時(shí)間長,操作復(fù)雜,需要大型精密儀器,不宜廣泛推廣。目前雌二醇的快速檢測(cè)方法主要包括化學(xué)或生物傳感器法,其中,基于受體的雌激素類物質(zhì)檢測(cè)方法可以檢測(cè)所有具有雌激素活性的物質(zhì),靈敏度較高,但無法區(qū)分哪一種雌激素?；诳贵w的ELISA法雖然具有較好的靈敏度和特異性,但其操作過程中需要多個(gè)洗滌步驟;基于抗體的膠體金免疫層析試紙操作簡單方便,但該方法對(duì)抗體要求高,且抗體用量大,由于高親和力雌激素抗體較貴,導(dǎo)致檢測(cè)成本高;而且由于抗體需要低溫保存,對(duì)保存和運(yùn)輸要求較高。因此亟需開發(fā)更為簡單方便、成本低廉的雌二醇快速檢測(cè)方法。核酸適配體作為一種新型識(shí)別分子,其本質(zhì)是一段20~100bp長的單鏈DNA,可以通過折疊形成一定的構(gòu)象與靶標(biāo)進(jìn)行特異性結(jié)合。核酸適配體通過SELEX技術(shù)從1014~1018文庫中篩選出,因此具有極高的親和力,而且相對(duì)抗體而言,性質(zhì)更為穩(wěn)定,靶標(biāo)范圍更廣,已經(jīng)被廣泛用于建立比色、電化學(xué)、化學(xué)發(fā)光、熒光等各種檢測(cè)方法。其中適配體納米金比色技術(shù)具有簡單、快速、靈敏、結(jié)果肉眼可見等優(yōu)點(diǎn),便于開發(fā)便攜和現(xiàn)場(chǎng)使用的快速檢測(cè)試劑盒或裝置,為環(huán)境污染物監(jiān)測(cè)提供了一種新的檢測(cè)方法。本文利用雌二醇適配體結(jié)合納米金比色技術(shù),建立了基于適配體納米金比色技術(shù)的雌二醇快速檢測(cè)方法,該方法可以檢測(cè)低至10ng/mL的雌二醇,且可在20min內(nèi)完成,結(jié)果肉眼可見、操作簡單,顯示了良好的應(yīng)用前景。1實(shí)驗(yàn)方法1.1克氏原螯蝦c雌二醇適配體參考文獻(xiàn)委托上海生物工程有限公司合成,序列為:GCTTCCAGCTTATTGAAT-TACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC,儲(chǔ)存于4℃冰箱,使用前用純水溶解,并于紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm處的吸收值,計(jì)算適配體濃度。雌二醇、雌三醇、雌酮、雙酚A、己烯雌酚、19-去甲睪酮、四氯金酸、檸檬酸三鈉(Sigma-Aldrich公司);甲醇、NaCl(北京化學(xué)試劑公司);96孔可拆酶標(biāo)板(Corning公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q(Millipore,Bedford,MA,USA)純化去離子水。適配體濃度測(cè)定及納米金溶液光譜吸收在NanoDrop2000c掃描紫外分光光度計(jì)(ThermoFisherScientificInc,Wilmington,USA)上完成。納米金溶液圖片由索尼TX20數(shù)碼相機(jī)拍攝。1.2haucl4溶液的配制利用檸檬酸三鈉還原四氯金酸法合成13nm納米金,具體步驟為:在劇烈攪拌下向100mL煮沸的1mmol/LHAuCl4溶液加入10mL38.8mmol/L的檸檬酸三鈉溶液,繼續(xù)煮沸20min,然后室溫冷卻。將制備的納米金溶液滴加到覆有碳膜的銅網(wǎng)上,蒸干后采用透射電鏡(JEM2010,200kV)對(duì)納米金顆粒進(jìn)行表征,DigitalMicorgraph軟件對(duì)納米顆粒直徑進(jìn)行分析。1.3紫外分光光度法檢測(cè)雌二醇的適配體納米金比色方法為:首先取50μL適配體與50μL納米金結(jié)合,孵育5min后,加入50μL雌二醇溶液,再孵育5min后,加入10μL的2mol/LNaCl溶液,5min觀察顏色變化并用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定520,620nm的吸光度值。根據(jù)OD620和OD520的比值變化確定樣品中雌二醇的濃度。1.4加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)為了檢驗(yàn)該方法的實(shí)用性,采集北京市內(nèi)河水作為實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。河水樣品經(jīng)0.22μm濾膜過濾后,分別添加不同濃度雌二醇(10,20,100ng/mL)進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)濃度樣品平行配制4份進(jìn)行分析。2結(jié)果與討論2.1dna最佳添加量納米金作為一種制備簡單、易于吸附生物分子的納米材料,具有極高的消光系數(shù)(比普通有機(jī)染料高3個(gè)數(shù)量級(jí))和強(qiáng)烈的粒子間距光學(xué)效應(yīng),其在分散狀態(tài)下呈紅色,發(fā)生凝聚后變?yōu)樗{(lán)色,反之也可由藍(lán)色變?yōu)榧t色,因此納米金比色法的靈敏度可以達(dá)到熒光法的靈敏度。正常情況下,向納米金溶液中加入高濃度鹽溶液,會(huì)破壞膠體溶液的穩(wěn)定性,使得納米金顆粒發(fā)生凝聚,溶液的吸收峰右移,溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。單鏈DNA適配體可以吸附到納米金表面,保護(hù)納米金顆粒在高濃度鹽溶液中不發(fā)生凝聚,溶液保持紅色。但如果向吸附有適配體的納米金溶液中加入靶標(biāo)時(shí),靶標(biāo)結(jié)合適配體使其從納米金表面解離,失去保護(hù)的納米金溶液在高濃度鹽作用下變?yōu)樗{(lán)色,而且變色的程度與靶標(biāo)的濃度成正比。根據(jù)此原理(見圖1),本文首次建立了基于適配體的雌二醇納米金比色快速檢測(cè)方法。2.2納米金顆粒的制備由于適配體納米金比色法檢測(cè)靶標(biāo)是基于靶標(biāo)和納米金競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體的原理,因此適配體濃度是影響檢測(cè)方法靈敏度的關(guān)鍵因素。首先利用檸檬酸三鈉還原四氯金酸法,合成了13nm的納米金顆粒(圖2),該溶液呈紅色,最高吸收峰在520nm處。然后固定納米金溶液用量,加入一系列濃度的適配體,孵育5min后,加入2mol/L氯化鈉,觀察納米金溶液顏色變化。結(jié)果表明,大于等于1μmol/L的雌二醇適配體可以保護(hù)納米金溶液,使其在高鹽濃度下保持紅色,而低于1μmol/L適配體時(shí),在鹽溶液的作用下,納米金溶液失去穩(wěn)定性,顏色變紫,因此選擇檢測(cè)雌二醇的適配體濃度為1μmol/L。2.3醇對(duì)納米金溶液色譜分析的影響利用適配體納米金比色法測(cè)定雌二醇,雌二醇濃度越高,納米金溶液顏色越藍(lán),OD620和OD520比值則越大,反之雌二醇濃度越低,納米金溶液顏色越紅,OD620和OD520比值則越小。從圖3A可以看出,在無雌二醇的情況下,納米金溶液依然保持紅色,隨著雌二醇濃度的增加,顏色由紅變紫,直到變成藍(lán)灰色,100ng/mL雌二醇即可引起納米金溶液明顯的顏色變化。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定450~750nm范圍內(nèi)納米金溶液吸光度的變化,從圖3B可以看出,隨著雌二醇濃度的增加,納米金溶液的吸收峰逐漸右移,表現(xiàn)為450~550nm處的吸光度降低,而550~750nm范圍的吸光度升高,這與納米金溶液顏色由紅到藍(lán)的變化一致。分別測(cè)定OD620和OD520吸光度,計(jì)算其比值,發(fā)現(xiàn)低至10ng/mL的雌二醇即可引起OD620/OD520比值的明顯增加。以雌二醇濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(x),OD620和OD520吸光度比值為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示雌二醇濃度在10~10000ng/mL范圍內(nèi)與吸光度比值呈明顯的線性相關(guān),線性方程為y=0.2718x+0.1374,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.8633。因此利用本方法,通過肉眼觀察納米金顏色變化,即可以檢測(cè)低至100ng/mL的雌二醇,借助簡單的紫外分光光度計(jì),檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到10ng/mL。2.4人工誘導(dǎo)納米金溶液的性質(zhì)靈敏度與特異性是檢驗(yàn)分析方法性能的重要指標(biāo)。采用本方法測(cè)定了多種雌激素活性物質(zhì)以及溶劑甲醇對(duì)檢測(cè)的影響。如圖4A所示,向雌二醇適配體保護(hù)的納米金溶液中加入不同濃度的19-去甲睪酮、雌三醇和雌酮,當(dāng)濃度增加至1000ng/mL時(shí),這3種激素同樣可以結(jié)合雌二醇適配體,使其從納米金表面解離,納米金顆粒進(jìn)而發(fā)生凝聚,導(dǎo)致溶液由紅變藍(lán)。為進(jìn)一步檢驗(yàn)該方法的特異性,檢測(cè)了溶解激素用的溶劑甲醇以及另外兩種常見雌激素類似物己烯雌酚和雙酚A。如圖4B所示,向雌二醇適配體保護(hù)的納米金溶液中分別加入高濃度(10000ng/mL)的上述非特異性物質(zhì),發(fā)現(xiàn)甲醇、雙酚A和己烯雌酚均不能誘導(dǎo)納米金溶液變藍(lán)。通過對(duì)上述幾種非特異物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比較可以看出(圖4C),雌三醇、19-去甲睪酮、雌酮和雌二醇,均具有環(huán)戊烷并多氫菲環(huán)的母核結(jié)構(gòu),由于適配體與靶標(biāo)是基于構(gòu)象進(jìn)行結(jié)合,所以這種結(jié)構(gòu)的類似性可以解釋雌三醇、19-去甲睪酮和雌酮與雌二醇適配體具有較高的交叉反應(yīng)。進(jìn)一步分析可以看出,與雌二醇、雌三醇和19-去甲睪酮相比,雌酮在環(huán)戊烷環(huán)17位的羥基變成了酮基,而交叉反應(yīng)結(jié)果顯示(圖4A),雌酮與雌二醇的交叉明顯小于雌三醇、19-去甲睪酮與雌二醇的交叉,濃度為1000ng/mL時(shí),雌二醇、雌三醇和19-去甲睪酮已經(jīng)誘導(dǎo)納米金溶液變藍(lán),而雌酮在1000ng/mL時(shí)誘導(dǎo)納米金溶液為紫紅色,直到10000ng/mL時(shí)才變?yōu)樗{(lán)色。由此可以推斷,雌二醇的適配體與靶標(biāo)的結(jié)合位置可能位于環(huán)戊烷環(huán)位置。具有雌激素活性的雙酚A、己烯雌酚與上述雌激素具有完全不同的構(gòu)象,因此即使在很高濃度下也未能誘導(dǎo)納米金溶液變色。這些結(jié)果說明雌二醇適配體能夠特異識(shí)別環(huán)戊烷并多氫菲環(huán)結(jié)構(gòu),可用于此類物質(zhì)的特異性檢測(cè)。2.5加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步檢驗(yàn)該方法檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)的基質(zhì)效應(yīng),取北京市河水樣品過濾后分別添加不同濃度的雌二醇進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表1。從表1可以看出,低濃度加標(biāo)樣品的基質(zhì)效應(yīng)稍高,回收率為112%,RSD(n=4)為8.4%,3個(gè)加標(biāo)濃度下的回收率為