美斯地濃緩釋片在兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究

美斯地濃緩釋片在兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究

美斯茨坦是一種抗膽紅素藥物，具有抑制膽堿酯酶的活性，可以防止膽堿通過神經(jīng)末梢釋放的乙酰磷堿破壞，阻礙乙酰磷堿在間隙中積聚，并對解毒效應(yīng)和煙堿反應(yīng)的膽堿反應(yīng)起到啟發(fā)作用。此外,對運(yùn)動(dòng)終板上的煙堿樣膽堿受體有直接興奮作用,并能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿,從而提高胃腸道、支氣管平滑肌和全身骨骼肌的肌張力,是一種有效的膽堿酯酶抑制劑。目前,美斯地濃主要?jiǎng)┬陀衅瑒?、膠囊和注射劑,其片劑需每日服用3次,血藥濃度波動(dòng)較大,可能影響療效及增加藥物不良反應(yīng)。為了減少服藥次數(shù),降低血藥濃度波動(dòng),減少不良反應(yīng),本實(shí)驗(yàn)室制備了日服1次的美斯地濃緩釋片,并以美斯地濃市售普通片作為參比制劑,研究美斯地濃緩釋片在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)與生物等效性,為臨床合理用藥提供依據(jù)。1材料和方法1.1高速板式離心和phs-4型ph測試方法LC-2010A高效液相色譜儀器(日本島津公司);TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)(江蘇省金壇市大地自動(dòng)化儀器廠);pHS-3C型pH測定儀(上海精科儀器有限公司);XW-80AVortex旋渦混合器(上海精科儀器有限公司)。1.2緩釋片、對照品受試制劑:美斯地濃緩釋片(180mg,實(shí)驗(yàn)室自制);參比制劑:市售美斯地濃緩釋片普通片(60mg,上海三維制藥有限公司);溴新斯的明對照品(中國藥品生物制品鑒定所);美斯地濃對照品(中國藥品生物制品鑒定所);甲醇、乙腈、庚烷磺酸鈉為色譜純,其余試劑均為分析純,水為雙蒸餾水。1.3實(shí)驗(yàn)中心新西蘭兔(6只,♀♂兼用,重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心),體質(zhì)量(2.5±0.5)kg,許可證號(hào):SCXK-(渝)2009-0001。1.4藥物方案與血液樣本的采集1.4.1地濃緩釋片及市售美斯地濃普通片采用隨機(jī)分組、自身對照交叉實(shí)驗(yàn)方法,將6只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為2組,每組3只,禁食12h后分別給予口服美斯地濃緩釋片或市售美斯地濃普通片,各相當(dāng)于主藥180mg,經(jīng)7d洗脫期后,進(jìn)行第2周期給藥。給藥前取空白血,給藥后于0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24、36、48h耳緣靜脈取血1.0ml于肝素化離心管中,12000r·min-1離心5min,取上層血漿,-20℃冰箱中保存待測。1.4.2不同給藥時(shí)間單次給藥采用隨機(jī)分組、自身對照交叉實(shí)驗(yàn)方法,將6只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為2組,每組3只,禁食12h后分別給予口服美斯地濃緩釋片或市售美斯地濃普通片,連續(xù)給藥7d?？诜忈屍M每日給藥1次,每次180mg,分別于d5～7給藥前及d7給藥后0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24、36、48h耳緣靜脈取血1.0ml;口服普通片組前6d每日給藥3次,每次60mg,d7一次性給藥180mg,分別于d5～7給藥前及d7給藥后0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24、36、48h耳緣靜脈取血1.0ml,所得血樣置于肝素化離心管中,12000r·min-1離心5min,取上層血漿,-20℃冰箱中保存待測。經(jīng)7d洗脫期后,進(jìn)行第二周期給藥。1.5預(yù)防磷酸二氫鈉活性取血漿樣品0.5ml于離心管中,加640mg·L-1新斯的明標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo))50μl,0.1mol·L-1苦味酸氫氧化鈉溶液(pH7.0)250μl,0.1mol·L-1磷酸二氫鈉溶液200μl,水飽和二氯甲烷6.0ml,旋渦混合5min,3000r·min-1離心10min,將有機(jī)相移至離心管中,加入0.1mol·L-1四丁基氯化銨溶液200μl,旋渦30s,3000r·min-1離心2min,取上層水相20μl進(jìn)樣量。1.6分析的建立和確認(rèn)1.6.1方法論的特殊性取空白血漿、含藥血漿樣品各0.5ml,按照血漿樣品處理后進(jìn)樣HPLC分析。1.6.2流動(dòng)相、流速色譜柱:LichrospherC18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:水相(含0.01mol·L-1庚烷磺酸鈉,pH3.0)-乙腈(76∶24);流速:1ml·min-1;檢測波長:269nm;柱溫:30℃。1.6.3樣品前處理取空白血漿0.5ml,加入不同濃度的美斯地濃標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為0.25、2.5、5、12.5、25、50、100mg·L-1的血漿樣品,按照“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析。以藥物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積之比R與藥物濃度C進(jìn)行線形回歸。1.6.4美斯地濃回收率試驗(yàn)在空白血漿中加入美斯地濃溶液適量配制成低、中、高(0.25、12.5、100mg·L-1)3個(gè)質(zhì)量濃度的美斯地濃血漿樣品,按照“1.5”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析,記錄色譜圖和峰面積,計(jì)算美斯地濃相對回收率;另用流動(dòng)相配置相應(yīng)濃度的美斯地濃對照品溶液,按照“1.5”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析,記錄色譜圖和峰面積,以此為標(biāo)準(zhǔn),將兩組峰面積相比,計(jì)算美斯地濃的絕對回收率。1.6.5清液進(jìn)樣配制低、中、高(0.25、12.5、100mg·L-1)3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品,按照“1.5”項(xiàng)下操作,取上清液進(jìn)樣。同日內(nèi)測定日內(nèi)精密度,連續(xù)5d測定日間精密度。1.6.6穩(wěn)定性試驗(yàn)配制低、中、高(0.25、12.5、100mg·L-1)3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品,分別置于室溫下放置12、24h,-20℃條件下存放3、7d,反復(fù)凍融2次后,按“2.3”項(xiàng)下操作處理,取上清液進(jìn)樣,考察樣品放置穩(wěn)定性。1.7藥代動(dòng)力學(xué)研究血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS2.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)模型擬合。1.8統(tǒng)計(jì)分析方法分別對單劑量和多劑量給予兔美斯地濃緩釋片與普通片劑后所得參數(shù)AUC0-t、AUC0-∞和Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析、雙單側(cè)t檢驗(yàn)及(1-2α)置信區(qū)間法統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2.1分析的建立和確認(rèn)2.1.1內(nèi)標(biāo)溴新斯溶液對美斯地濃的干擾空白血漿、含藥血漿樣品處理后進(jìn)樣分析,HPLC圖譜見Fig1。由圖可見,美斯地濃和內(nèi)標(biāo)溴新斯的明的保留時(shí)間分別為4.99、7.99min,血漿中其它物質(zhì)對美斯地濃的測定基本無干擾,血漿樣品中美斯地濃與血漿雜質(zhì)峰分離效果較好。2.1.2美斯地濃的c/l-1和c/l-1的線性關(guān)系不同濃度的美斯地濃血漿樣品,處理后進(jìn)樣分析。以藥物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積之比R與藥物濃度C進(jìn)行線形回歸,得C=0.025R-0.0066(n=5,r=0.9991),表明美斯地濃在0.25～100mg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線形關(guān)系。2.1.3返回率實(shí)驗(yàn)相對回收率和絕對回收率結(jié)果見Tab1。2.1.4精密度實(shí)驗(yàn)測定不同質(zhì)量濃度的血漿樣品的日間精密度結(jié)果見Tab2。2.1.5血漿中美斯地濃的測定測定不同質(zhì)量濃度的血漿樣品的穩(wěn)定性考察結(jié)果見Tab3。本實(shí)驗(yàn)采用的HPLC紫外法測定血漿中美斯地濃濃度,經(jīng)方法學(xué)研究表明其準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好,符合生物等效性指導(dǎo)原則關(guān)于生物樣品分析方法的基本要求。2.2藥動(dòng)學(xué)模型擬合血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS2.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)模型擬合,美斯地濃緩釋片與市售美斯地濃普通片的藥代動(dòng)力學(xué)都符合權(quán)重為1/C2的二室模型。單劑量、多劑量口服美斯地濃180mg后兩種制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見Tab4,5。血藥濃度-時(shí)間曲線見Fig2,3。2.3生物等效分析2.3.1參比制劑的tm文創(chuàng)兩種制劑的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax在制劑間和周期間差異均無顯著性(P>0.05);AUC0-t、AUC0-∞和Cmax的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的94%～105%、95%～104%、85%～114%,結(jié)果表明差異均無顯著性;受試制劑與參比制劑的Tmax用Wilcoxon法非參數(shù)檢驗(yàn),結(jié)果P<0.05,兩制劑的Tmax差異有顯著性。以AUC0-t計(jì)算相對生物利用度(F),以參比制劑為標(biāo)準(zhǔn),受試制劑的平均相對生物利用度為(117.3±11.0)%,以上結(jié)果可以得出:單劑量給藥受試制劑與參比制劑具有生物等效性。2.3.2參比制劑的tm文檢測兩種制劑的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax在制劑間和周期間差異均無顯著性(P>0.05);AUC0-t、AUC0-∞和Cmax的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的94%～105%、92%～107%、97%～102%,結(jié)果表明差異均無顯著性;受試制劑與參比制劑的Tmax用Wilcoxon法非參數(shù)檢驗(yàn),結(jié)果P<0.05,兩制劑的Tmax差異有顯著性。以AUC0-t計(jì)算相對生物利用度(F),以參比制劑為標(biāo)準(zhǔn),受試制劑的平均相對生物利用度為(106.7±6.4)%,以上結(jié)果可以得出:多劑量給藥受試制劑與參比制劑具有生物等效性。3生物等效性研究從藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及血藥濃度-時(shí)間曲線來看,自制緩釋片的達(dá)峰濃度比市售普通片小,達(dá)峰時(shí)間與半衰期延長,服藥24h后的血藥濃度均高于普通片,釋藥時(shí)間有所延長,緩釋片的平均滯留時(shí)間MRT較參比制劑延長,證明了自制緩釋制劑具有良好的緩釋效