超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食用貝類及其制品中原多甲藻酸的方法研究

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食用貝類及其制品中原多甲藻酸的方法研究

近年來，在歐洲發(fā)現(xiàn)了新的聚醚類生物毒素（azas），該菌株最初于1995年檢測到愛蘭治亞灣的紫培骨。它是一種具有6,5,6-三螺環(huán)和環(huán)胺結(jié)構(gòu)的親脂性聚醚類海洋生物毒素,嚴(yán)重威脅到水產(chǎn)品食用安全。目前已確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的原多甲藻酸貝類毒素有11種,其中AZA-1~AZA-3是原多甲藻產(chǎn)生的天然產(chǎn)物,是最A(yù)ZA-1的RfD值為0.04μg/kg,遠(yuǎn)低于其他貝類毒素(大田軟海綿酸(OA)的RfD值為0.33常見且毒性最大的3種(結(jié)構(gòu)式見表1);AZA-4~AZA-11是貝類經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。AZAs主要引起人體胃腸道功能紊亂,研究發(fā)現(xiàn),這類毒素相對比較穩(wěn)定,在酸性、堿性和高溫條件下都不能使其毒性降低。由聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)、世界衛(wèi)生組織(WHO)和國際奧林匹克委員會(IOC)聯(lián)合成立的雙殼貝類毒素專家組初步確定了貝類毒素急性致毒的參考劑量(referencedose,RfD),其中μg/kg)。鑒于原多甲藻酸貝類毒素的危害性,歐盟立法機(jī)構(gòu)確立雙殼軟體動物中AZA(AZA-1~AZA-3)的最大允許限量(MRL)是160μg/kg。目前報道的原多甲藻酸的檢測方法主要包括生物測試法、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法等。對于生物法檢測,最初人們借鑒小鼠腹腔注射測試腹瀉性貝類毒素的方法分析AZA:取貝類消化腺,提取毒素,統(tǒng)計死亡時間進(jìn)行定量。但由于AZA在貝類體內(nèi)廣泛分布,消化腺內(nèi)的毒素只占0~40%,因此,生物檢測的結(jié)果往往會產(chǎn)生假陰性而造成實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。液相色譜技術(shù)是分析生物毒素的一種高效手段。但由于AZA毒素在大于210nm的波長范圍缺少特征吸收峰,因此目前還未見采用液相色譜分析AZA的相關(guān)報道。隨著液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展和不斷完善,人們逐漸嘗試建立了一些LC-MS分析方法來測定這類毒素[11,12,13,14,15,16,17]。由于貝類海產(chǎn)品及其制品基質(zhì)較為復(fù)雜,采用單級質(zhì)譜測定的結(jié)果可能會產(chǎn)生假陽性。采用超高效液相色譜和三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),分析測定可食用貝類及其制品中的3種原多甲藻酸貝類毒素,采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測,用標(biāo)準(zhǔn)對照品進(jìn)行外標(biāo)法定量。相比單級質(zhì)譜檢測,串聯(lián)質(zhì)譜法的重復(fù)性更好,靈敏度更高,采用MRM模式進(jìn)行定性和定量測定在很大程度上降低了假陽性結(jié)果的出現(xiàn),使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。液相色譜-高分辨率質(zhì)譜在貝類毒素的檢測領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用,在高分辨率掃描模式下可以鎖定目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù),提高檢測的準(zhǔn)確度,但高分辨率質(zhì)譜的運(yùn)行和維護(hù)成本較高,操作難度也比較大。綜合比較幾種方法,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)相比單級質(zhì)譜和生物法,在檢測的靈敏度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性方面都具有較明顯的優(yōu)勢,且操作較為簡便,運(yùn)行成本適中,比較適合可食用貝類產(chǎn)品及制品中多種原多甲藻酸貝類毒素的分析測定。上述文獻(xiàn)報道的方法采用的樣品凈化技術(shù)多為液-液萃取和固相萃取法。QuEChERS是目前一種通用性強(qiáng)、快速且簡便的前處理方法,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、毒素等檢測中[19,20,21,22,23,24],因此本文采用該技術(shù)作為樣品的凈化方法。本文采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行分析測定,不但節(jié)省試劑消耗,更提高了分析效率,3個毒素化合物在7min內(nèi)可完成分析,較好地實現(xiàn)了對貽貝、蚌類等可食用貝類及其制品基體中3種AZA貝類毒素(AZA-1、AZA-2、AZA-3)的分析與測定。1實驗部分1.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);高速均質(zhì)機(jī)(美國Waring公司);離心機(jī)(美國Sigma公司);漩渦混勻器(德國IKA公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司);Milli-Q超純水裝置(美國Millipore公司)。3種原多甲藻酸標(biāo)準(zhǔn)品AZA-1、AZA-2和AZA-3(純度均≥99.0%,美國Supelco公司);乙腈、乙酸銨(色譜純,美國Fisher公司);甲酸(色譜純,美國Tedia公司);無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純,國藥化學(xué)試劑公司);C18分散固相萃取(DSPE)吸附劑(美國Agilent公司);微纖維濾紙(美國VICAM公司);微孔濾膜(0.2μm,美國Whatman公司);實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)過濾的超純水(電阻率為18.2MΩ·cm)。用甲醇配制3種原多甲藻酸貝類毒素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20℃下保存,保存期為6個月;制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時,根據(jù)要求將儲備液稀釋成不同濃度,于-20℃條件下保存。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線現(xiàn)用現(xiàn)制作。貽貝、牡蠣、象拔蚌和扇貝4種食用貝類及其制品購于北京某海鮮超市。1.2-質(zhì)量分析的質(zhì)量分析條件1.2.1流動相、柱溫度和洗脫程序色譜柱:ZORBAXEclipsePlusC18柱(50mm×2.1mm,1.8μm);流動相:乙腈(A)和水(含5mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)(B);流速:400μL/min;進(jìn)樣量:5μL;柱溫:40℃。梯度洗脫程序:0~1min,20%A~50%A;1~6min,50%A~90%A;6~7min,90%A;7~7.5min,90%A~20%A。1.2.2溫度和并發(fā)癥離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;載氣溫度:300℃;載氣流量:6L/min;霧化器壓力:3.1MPa;鞘氣溫度:300℃;鞘氣流量:11L/min;毛細(xì)管電壓:3500V;噴嘴電壓:400V;掃描方式:MRM模式。1.3微纖維濾紙的制備試樣制備:用尖銳物品將試樣去殼,將沙土及其他固體顆粒用清水沖洗去掉,瀝干后稱取200g洗凈的樣品,置于潔凈的密封袋中,放入-20℃的冰箱中保存,避免試樣間的交叉污染(可直接食用的樣品直接稱取即可)。提取和凈化:準(zhǔn)確稱取制備好的試樣10g(精確至0.01g)于均質(zhì)杯中,分別加入25mL85%乙腈水溶液提取液、5g無水硫酸鎂和2g氯化鈉,在20000r/min轉(zhuǎn)速下均質(zhì)60s,用微纖維濾紙過濾;取10mL濾液至離心管中,加入0.5gC18DSPE吸附劑和1g無水硫酸鎂,漩渦振蕩1min,在7000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min,取5mL上清液移至錐形瓶中,在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,以0.8mL乙腈和0.2mL水溶解,漩渦振蕩30s,過0.2μm微孔濾膜,濾液待儀器分析測定。1.4加標(biāo)回收率試驗選用不含上述3種原多甲藻酸的扇貝樣品,分別添加3個水平(10、20和50μg/kg)的原多甲藻酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按上述方法處理及測定,計算回收率。用純水代替試樣,按照上述步驟進(jìn)行空白試驗。2結(jié)果與討論2.1損害是否可選的試樣由于AZAs在貝類的肌肉和內(nèi)臟等組織中的富集程度各不相同,如AZA-1主要分布于消化腺,而AZA-3則主要分布于消化腺以外的其他組織,因此在取樣時,應(yīng)取除外殼的整個部分(包含肌肉和內(nèi)臟)作為試樣,以確保樣品的均一性和代表性。2.2提取方式和時間對提取效果的影響原多甲藻酸貝類毒素是一類脂溶性聚醚化合物,易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。試驗分別考察了乙酸乙酯、甲醇、乙腈3種提取液的提取效率。試驗結(jié)果表明乙腈的提取效率相對較好。但由于貝肉中富含大量的蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì),使用100%乙腈進(jìn)行提取時,會增加粗提液中干擾雜質(zhì)的含量,給凈化步驟增加難度。因此,試驗還比較了不同比例的乙腈-水體系的提取效果。結(jié)果表明,乙腈-水(85∶15,v/v)混合液的提取效果最好(見表2)。常見的樣品提取方式主要有振蕩提取、均質(zhì)提取、超聲提取等。試驗分別考察了不同提取方式對提取效率的影響。結(jié)果表明均質(zhì)提取的效果最好(見表2)。以AZA-1為例,采用均質(zhì)提取比采用超聲提取和振蕩提取獲得的回收率分別高29%和24%。提取溫度和提取時間往往會對提取效果有一定的影響,因此試驗考察了不同提取時間和提取溫度對提取效果的影響。試驗結(jié)果表明至少60s才能夠保證目標(biāo)化合物的提取效率。此外,我們還考察了不同溫度下的提取效果。結(jié)果表明,在室溫、40℃和70℃下,目標(biāo)化合物的提取效果并無明顯差異(見表2),這說明溫度對提取的影響不大。通過正交試驗最終確定的提取條件:室溫條件下,以乙腈-水(85∶15,v/v)溶液作為提取液,采用高速均質(zhì)儀器將樣品均質(zhì)60s。2.3無水硫酸鎂和氯化鈉的加入量本實驗以貝類樣品的基質(zhì)特點(diǎn)為基礎(chǔ),參照QuEChERS的基本原理,針對貝類產(chǎn)品及其制品的基質(zhì)特點(diǎn)和目標(biāo)化合物的特性,優(yōu)化了適用的提取凈化條件并得到了較為滿意的結(jié)果。為了提高提取效率,提取時加入了無水硫酸鎂和氯化鈉。無水硫酸鎂能夠幫助目標(biāo)化合物在提取溶液中更好地分散,使提取更加容易;氯化鈉則能夠使溶液體系中的水趨于相飽和,促使目標(biāo)化合物分散至有機(jī)相并有助于水相和乙腈相分層,從而提高提取效率。試驗分別考察了無水硫酸鎂和氯化鈉的加入量對AZAs提取效率的影響。結(jié)果表明,5g無水硫酸鎂和2g氯化鈉的加入即能夠獲得較好的提取效率。其中對AZA-1提取效率的影響見圖1。2.4最佳凈化方案的確定分析測定常用的凈化方法主要有液-液萃取、蛋白質(zhì)沉淀、凝膠凈化、固相萃取等,其中固相萃取技術(shù)是近年來食品分析中最常見的一類凈化方法。隨著固相萃取技術(shù)的發(fā)展,涌現(xiàn)出一些新型的固相萃取技術(shù),如固相微萃取(SPME)、攪拌棒吸附萃取(SBSE)、基質(zhì)DSPE、分子印跡固相萃取(MISPE)、免疫親和固相萃取(IASPE)、整體柱固相萃取(monolithicSPE)、碳納米管固相萃取(CNTSPE)等。這些凈化技術(shù)各有優(yōu)點(diǎn),具有各自適合的應(yīng)用范圍,且不同的吸附劑填料也對凈化效果有顯著的影響。Florisil硅土作為強(qiáng)極性吸附劑,無法去除提取液中的脂類雜質(zhì),AZAs的回收率偏低;石墨化碳(GCB)通常用于去除色素成分,并且對含苯環(huán)官能團(tuán)的化合物具有較強(qiáng)的吸附作用;N-丙基-乙二胺(PSA)能有效去除基質(zhì)中的脂肪酸和甾醇類基質(zhì),但考慮到PSA作為堿性吸附填料會對AZAs這類酸性化合物有較強(qiáng)的吸附作用,因此使用時需添加一定量的酸以減少損失;C18吸附劑可有效去除脂類、糖類等親脂型雜質(zhì),對AZAs這類化合物的適用性較好,但過量的C18吸附劑也會吸附目標(biāo)化合物而使回收率降低,因此需要對C18吸附劑的使用量進(jìn)行優(yōu)化。幾種吸附劑各有特點(diǎn),而我們需要在檢測靈敏度、最佳凈化效果和合理回收率之間尋求平衡點(diǎn)。本實驗采用了DSPE技術(shù)進(jìn)行凈化處理,試驗通過優(yōu)化最終確定了使用C18吸附劑(按照實驗確定的最終前處理步驟,每20g樣品中加入1g吸附劑),并配以1g無水硫酸鎂可以達(dá)到較好的凈化效果。2.5流動相的譜保留行為為了獲得最好的色譜分析效果,考察了乙腈-水和甲醇-水兩種混合溶劑體系作為流動相時目標(biāo)化合物的色譜保留行為。結(jié)果表明,使用甲醇-水體系作為流動相時,85%以上比例的甲醇才可將目標(biāo)化合物洗脫下來,但當(dāng)甲醇比例達(dá)到90%時,3種原多甲藻酸貝類毒素?zé)o法實現(xiàn)基線分離。而乙腈的洗脫能力較強(qiáng),當(dāng)采用乙腈-水體系作為流動相時,3種AZAs在7min內(nèi)即可實現(xiàn)基線分離(見圖2)。2.6質(zhì)譜條件優(yōu)化3種原多甲藻酸貝類毒素均在ESI+模式下電離,通過總離子流掃描可以看出,AZAs形成的準(zhǔn)分子離子峰中[M+H]+峰的豐度最高。參考?xì)W盟2002/657/EC指令,以準(zhǔn)分子離子為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,選擇豐度較高的兩個碎片離子作為定量和定性離子,分別優(yōu)化各個離子對的錐孔電壓(fragmentorvoltage)及碰撞電壓(collisionvoltage)。綜合所有離子對獲得最強(qiáng)響應(yīng)信號時的質(zhì)譜條件,優(yōu)化了質(zhì)譜載氣溫度及流量、鞘氣溫度及流量、霧化氣壓力、毛細(xì)管電壓和噴嘴電壓。這些參數(shù)中影響靈敏度的最主要參數(shù)是錐孔電壓和碰撞能量,其中錐孔電壓的高低影響母離子的傳輸效率:該電壓過低,可能導(dǎo)致母離子傳輸效率低;但過高,會使母離子在傳輸過程中碎裂,從而降低目標(biāo)離子的檢測靈敏度。由于AZAs的質(zhì)量數(shù)較大,因此錐孔電壓應(yīng)設(shè)置略高一些。3種AZAs碎裂后產(chǎn)生的主要碎片離子包含脫一個水分子、脫兩個水分子的子離子和開環(huán)碎片離子。比較這些主要碎片離子的強(qiáng)度和穩(wěn)定性,最終選擇[M+H-H2O]+和[M+H-2H2O]+作為定量離子和定性離子。3種原多甲藻酸貝類毒素的質(zhì)譜分析參數(shù)見表3,空白扇貝樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品的MRM質(zhì)譜圖見圖3。2.7方法學(xué)評價2.7.1線性回歸與定量限、loq值的測定3種AZAs采用基質(zhì)曲線-外標(biāo)法進(jìn)行定量。用空白樣品提取液配制含量為1~100μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以含量為橫坐標(biāo)X(μg/kg)和定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸,所得相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995。根據(jù)S/N=10確定化合物的定量限(LOQ)。樣品中3種原多甲藻酸貝類毒素的LOQ均為1.0μg/kg。表4列出了扇貝中3種AZAs的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和LOQ。2.7.2加標(biāo)回收率試驗歐盟立法機(jī)構(gòu)確立雙殼軟體動物中AZAs(AZA-1~AZA-3)的最大允許限量(MRL)是160μg/kg。選用不含上述3種毒素的貝類產(chǎn)品及其制品為空白樣品,分別添加10、20、50μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收試驗,每個添加水平進(jìn)行6次重復(fù)試驗。AZA-1~AZA-3在3個添加水平下的回收率范圍分別