微藻育種技術(shù)研究進(jìn)展

微藻育種技術(shù)研究進(jìn)展

微藻是指在顯微鏡下可以區(qū)分形狀的微藻組。它有2萬多種類型，數(shù)量巨大。它是水生生態(tài)系統(tǒng)的主要制造商。由于微藻在進(jìn)化上具有多源性和遺傳的多樣性,藻細(xì)胞中含有一些特殊的次級(jí)代謝物,可以通過對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng),從藻液中提取不飽和脂肪酸、蝦青素、藻藍(lán)蛋白、隱藻素、甲藻毒素、活性多糖等各種生物活性物質(zhì),以及生產(chǎn)保健食品和海洋藥物等,同時(shí)也是開發(fā)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的優(yōu)良材料。但是,能實(shí)現(xiàn)規(guī)模養(yǎng)殖的微藻種類少,適合養(yǎng)殖的地理范圍窄,可提取的高價(jià)值成分含量低且提純困難,這大大地阻礙了微藻的開發(fā)利用。我國(guó)現(xiàn)階段商業(yè)化的微藻產(chǎn)品主要是藻粉等粗制品,進(jìn)一步開發(fā)微藻資源,提高微藻產(chǎn)品價(jià)值是當(dāng)前亟待解決的問題。選擇具有抗病和生活力強(qiáng)、生長(zhǎng)快和繁殖迅速以及抗逆境脅迫和特殊活性物質(zhì)累積含量高等優(yōu)良性狀的藻種,將是提高微藻產(chǎn)品價(jià)值和微藻產(chǎn)業(yè)效益的重要途徑。本文綜述了微藻育種的研究現(xiàn)狀及前景,并對(duì)葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在微藻育種中的應(yīng)用進(jìn)行了初步探討。1自然藻藻種的制備選擇育種是一切育種實(shí)踐的基礎(chǔ),在藻類遺傳育種中占有很重要的地位。通常是采用馴化與自然分離方法,此法簡(jiǎn)單易行,但藻株發(fā)生變異的機(jī)率較小,育種周期長(zhǎng),選育的微藻普遍存在遺傳性狀不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。譚桂英等通過鏡檢,逐級(jí)稀釋法,獲得了不同形態(tài)大小的鈍頂螺旋藻藻絲體6株,其中S6具有個(gè)體大,易上浮,生長(zhǎng)速度快,蛋白質(zhì)含量高,經(jīng)海水馴化,能在海水中良好生長(zhǎng)等特點(diǎn)。胡鴻鈞等從我國(guó)內(nèi)陸鹽湖中分離、培育出2株鈍頂螺旋藻新品系,EPA(二十碳五烯酸)含量達(dá)到16.45mg/g(目前已知含量最高),DHA(二十二碳六烯酸)含量為7.88~9.50mg/g,粗蛋白含量達(dá)到67.9%(干重),且較耐高溫。殷春濤等等將5個(gè)鈍頂螺旋藻品系進(jìn)行單種分離和擴(kuò)大培養(yǎng),綜合大量培養(yǎng)對(duì)藻種的基本要求如適應(yīng)性強(qiáng)、過濾效率高、生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)和咸寧基地的自然條件篩選出1株耐高溫且溫度適應(yīng)范圍廣(9℃~45℃)、蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸含量高的優(yōu)良螺旋藻品系(Sp)NS290020。張寶玉等研究了4種雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)品系在不同溫度下的生長(zhǎng)速率、生物量、蝦青素的含量和產(chǎn)量,從中選出了適合于大量培養(yǎng)、蝦青素含量和產(chǎn)量均較高的2個(gè)品系H.pluvialis26和H.pluvialisWZ。2個(gè)品系的溫度適應(yīng)具有互補(bǔ)性:在低溫季節(jié)使用H.pluvialisWZ,在高溫季節(jié)使用H.pluvialis26進(jìn)行生產(chǎn),可以延長(zhǎng)生長(zhǎng)期,提高產(chǎn)量。Running等利用小球藻(Chlorellapyrenoidosa)進(jìn)行L-抗壞血酸生產(chǎn),通過品種選育結(jié)合培養(yǎng)工藝的改進(jìn),其Vc的胞內(nèi)含量比親本高60倍。Katsuhiko等從15種自然藻類樣品中選育出1株新型綠藻GK12,經(jīng)鑒定表明該藻屬于綠藻門單殼縫藻屬,該藻在自養(yǎng)培養(yǎng)條件下,蝦青素含量可達(dá)(2.5±0.36)mg/g細(xì)胞干重,而且在無維生素的培養(yǎng)條件下也可積累蝦青素。選擇育種與誘變育種、基因工程等育種方法相比,具有藻株發(fā)生變異的機(jī)率較小,育種周期長(zhǎng)等缺點(diǎn),但是對(duì)環(huán)境、生物種群和人類不會(huì)造成大的威脅。如果將各種育種方法結(jié)合使用,取長(zhǎng)補(bǔ)短,會(huì)更加有利于微藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。2誘變育種誘變育種是指通過物理(射線照射等)和化學(xué)(誘變劑等)方法使藻類發(fā)生變異,從中選育出具有優(yōu)良性狀的藻種,是微藻育種中使用最多也是最有效的一種方法。誘變育種既能誘發(fā)基因突變,又能促進(jìn)遺傳基因重新組合,在短時(shí)間內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)良突變體作為新品種直接利用或作為種質(zhì)資源間接利用,具有選擇育種難以替代的優(yōu)點(diǎn)。2.1物理誘導(dǎo)和繁殖常用的物理誘變輻射源有紫外線、倍頻Nd:YAG激光、He-Ne激光、半導(dǎo)體激光、60Co-γ射線、超聲波等。2.1.1采用紫外誘變的方法篩選突變株孫福征等采用紫外輻射誘導(dǎo)巴氏杜氏藻(Dunaliellabardawil)突變,初步獲得1株巴氏杜氏藻的突變株,突變株的β-胡蘿卜素含量為原種6.2~15.5倍。黃瑞芳等采用紫外線輻射的方法對(duì)巴氏杜氏藻進(jìn)行誘變,經(jīng)過夏日高溫(42℃~52℃)篩選,得到1株耐高溫(42℃)的突變株,突變株的細(xì)胞體積是原出發(fā)株的3.0~3.4倍。李建宏等采用紫外誘變的方法篩選獲得了2株優(yōu)良的穩(wěn)定鈍頂螺旋藻突變株,與出發(fā)株相比,2株突變株的生長(zhǎng)速度和光合放氧速率均有顯著提高,藻藍(lán)蛋白含量高出20.2%。莊惠如等用紫外線連續(xù)2代誘變雨生紅球藻,經(jīng)篩選獲得的2個(gè)突變品系,生長(zhǎng)速率比出發(fā)株提高了8.2%~11.8%,蝦青素累積能力比出發(fā)株提高75.5%~89.3%。Lanfaloni等用紫外線和亞硝基胍誘變鈍頂螺旋藻,獲得抗8-氮鳥嘌呤或抗β-(2-噻嗯基)–DL氨基丙酸的抗性突變株,并從UV誘變處理中分離得到氯酸鹽抗性突變株。2.1.2用激光照射屑充藻體的研究激光輻射可以引起細(xì)胞DNA或RNA、質(zhì)粒、染色體畸變效應(yīng),酶的激活或鈍化,以及細(xì)胞分裂和細(xì)胞代謝活動(dòng)的改變,為激光誘變育種提供了有利條件。激光作為一種育種手段,具有簡(jiǎn)單、方便和安全等優(yōu)點(diǎn),在工業(yè)微生物育種中已取得不少進(jìn)展,而在微藻育種中的應(yīng)用則剛起步。趙萌萌等用不同劑量的He-Ne激光照射鈍頂螺旋藻,變異藻與出發(fā)藻株相比,藻體在形態(tài)、干重、蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素和胞外多糖等方面都有不同程度的變化,其中β-胡蘿卜素含量增幅18.1%。趙炎生等利用倍頻Nd:YAG激光誘變鈍頂螺旋藻,選出光合作用較強(qiáng)的藻株,其藻體蛋白質(zhì)含量增加12%,胞外多糖分泌量提高24.6%。趙學(xué)武等用YAG激光誘變鹽生杜氏藻,篩選到3個(gè)品系,突變品系β-胡蘿卜素含量較原藻增加19%。2.1.3超細(xì)礫頂螺釘突變體的篩選常用的射線有X射線、γ射線,這2種射線可以引起DNA鏈斷裂,當(dāng)修復(fù)不能恢復(fù)到原狀時(shí)就會(huì)出現(xiàn)突變。在微藻育種中常用的射線是60Co-γ射線,汪志平等用組織勻漿破碎和離心沉降法制備和分離出鈍頂螺旋藻的單細(xì)胞或少于5個(gè)細(xì)胞的片段,并用60Co-γ射線輻照處理,篩選出4株超長(zhǎng)鈍頂螺旋藻突變體,在室外培養(yǎng)時(shí),突變株的產(chǎn)量比出發(fā)株高11.7%。汪志平等用甲基磺酸乙酯(EMS)和60Co-γ射線處理鈍頂螺旋藻的單細(xì)胞或原生質(zhì)球,并用7.0kGy左右的γ射線為篩選壓力,得到了4株多糖含量分別比出發(fā)品系高32.8%,17.3%,23.4%和42.3%的形態(tài)突變體。Vladeanu等用60Coγ射線處理鈍頂螺旋藻,結(jié)果證明:3×10-2Gy和5×10-2Gy的劑量可促進(jìn)藻生長(zhǎng)、光合作用、核酸的合成、葉綠素a和類胡蘿卜素的增加。趙愛娟采用輻射劑量為100Gy、劑量率為8Gy/min的60Co-γ射線對(duì)小球藻輻射處理后,其EPA的含量比對(duì)照組提高了2.93%,采用輻射劑量為500Gy、劑量率為15Gy/min的60Co-γ射線對(duì)等鞭金藻輻射處理后,其EPA的含量比對(duì)照組提高了46.27%,由此可見射線誘變育種的關(guān)鍵在于選擇適宜的輻射參數(shù)。2.1.4超聲波對(duì)藻類細(xì)胞生長(zhǎng)的影響超聲波的生物學(xué)效用是多方面的,既可引起生物大分子變性導(dǎo)致細(xì)胞的損傷,又可促進(jìn)生物大分子的合成,加速生化反應(yīng)。近年來,超聲波在生物科學(xué)領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展,主要應(yīng)用于植物無基質(zhì)培養(yǎng)、生物活性物質(zhì)的提取、提高固化酶活性及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面,但在海洋微藻方面的應(yīng)用還較少。已有研究表明,只要超聲波的能量、頻率、處理時(shí)間適宜,便可提高藻類細(xì)胞生長(zhǎng)速度,從而提高細(xì)胞的蛋白質(zhì)及不飽和脂肪酸含量。張?jiān)獦?biāo)等研究了超聲輻射對(duì)亞心形扁藻生物學(xué)效應(yīng)的影響,在超聲條件為20kHZ、15s、6W2次時(shí),生長(zhǎng)速率為對(duì)照組的1.99~2.33倍;在超聲條件為18kHZ,10s,3W3次時(shí),其脂肪酸不飽和度比對(duì)照組提高3.5%~5.6%。李文權(quán)等研究了超聲波對(duì)湛江等鞭金藻的生物學(xué)效應(yīng),發(fā)現(xiàn)在超聲條件為20kHz,6W,10s3次時(shí),生長(zhǎng)速率常數(shù)最高可達(dá)到0.630d,是對(duì)照組的2.02倍;在超聲條件為20kHz,4~6W,30s時(shí),其脂肪酸不飽和度最高可達(dá)79.6%,比對(duì)照組提高了7.8%。殷春濤等利用超聲波處理鈍頂螺旋藻出發(fā)品系,獲得單細(xì)胞螺旋藻,然后用亞硝基胍(NTG)誘變篩選獲得突變品系。用4℃低溫處理突變品系和出發(fā)品系,突變品系更能忍耐低溫,其蛋白質(zhì)含量比出發(fā)品系提高9.5%。2.2微藻基因檢測(cè)化學(xué)誘變育種是用化學(xué)誘變劑處理微藻,以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變,從而引起形態(tài)特征的變異,然后根據(jù)育種目標(biāo),對(duì)這些變異進(jìn)行鑒定、培育和選擇,最終育成新品種。常用化學(xué)誘變劑的種類有烷化劑、核酸堿基類似物等?；瘜W(xué)誘變只需少量的藥劑和簡(jiǎn)單的設(shè)備,而且不同藥劑對(duì)不同植物、不同組織或細(xì)胞、不同染色體節(jié)段、不同基因的誘變有一定專一性,因此廣泛應(yīng)用于微藻育種中,并且取得了一定的成效。Zhang等用N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)誘導(dǎo)綠球藻(Chlorococcumsp),成功建立比野生品系蝦青素含量高2倍的突變體。Sivan等用MNNG處理紫球藻獲得了抗除草劑diuron和光系統(tǒng)Ⅱ抑制型除草劑atrazine突變型株。Cohen等用除草劑SAN29785作為生長(zhǎng)抑制劑,從鈍頂螺旋藻和紫球藻中篩選獲得突變株,其生長(zhǎng)速度及糖脂含量均高于出發(fā)株,且富含γ-亞麻酸。張學(xué)成等用MNNG處理小角刺藻和纖細(xì)角刺藻,在13℃低溫下,進(jìn)行種群和單細(xì)胞選擇,獲得在低溫下迅速繁殖的小角刺藻6株和纖細(xì)角刺藻2株。誘發(fā)突變技術(shù)及相關(guān)生物技術(shù)是改良和創(chuàng)建生物技術(shù)良種的一重要手段,雖然該技術(shù)對(duì)遺傳物質(zhì)DNA的操作不具有基因工程那么強(qiáng)的針對(duì)性,而且在操作時(shí)對(duì)人體及環(huán)境有一定的危害性,但誘變育種具有所需要儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn),因此在當(dāng)前開展微藻基因操作所需的技術(shù)和條件還不完備的情況下,誘變育種仍不失為一種創(chuàng)建微藻生物良種的有效而實(shí)用的重要手段。同時(shí),現(xiàn)代分子遺傳學(xué)和基因工程及相關(guān)科學(xué)技術(shù)極大地推動(dòng)了誘變技術(shù)的迅猛發(fā)展,使在分子水平上揭示突變的發(fā)生機(jī)理、突變體的快速鑒定及實(shí)現(xiàn)定向誘變成為可能。3微藻育種研究細(xì)胞融合是將2種不同植物的體細(xì)胞用酶分解法除去細(xì)胞壁,分離成裸露的原生質(zhì)體,再使2種原生質(zhì)體融合成雜種細(xì)胞,然后利用細(xì)胞的全能性在培養(yǎng)基上重新增生細(xì)胞壁,并進(jìn)行細(xì)胞的分裂、分化與生長(zhǎng)發(fā)育,再經(jīng)誘導(dǎo)形成雜種株,從中選優(yōu)去劣,按育種目標(biāo)要求培育出新品種,并創(chuàng)造出新物種。國(guó)內(nèi)外采用體細(xì)胞雜交育種技術(shù),在農(nóng)作物新品種選育方面取得了較多進(jìn)展,但是細(xì)胞融合技術(shù)在微藻育種中的應(yīng)用研究還較少。沈繼紅等利用細(xì)胞化學(xué)融合法,將生長(zhǎng)迅速的兼養(yǎng)微藻(四鞭藻)和富含EPA/DHA的自養(yǎng)微藻(綠色巴夫藻)進(jìn)行融合,篩選出1種新型的微藻,但是并未對(duì)其的生長(zhǎng)特征、活性物質(zhì)含量等進(jìn)行測(cè)定。Tjahjono等使用3種除草劑(噠草伏、氟啶酮、煙堿)對(duì)雨生紅球藻(Uaematococcuspluvialis)進(jìn)行誘變得到一系列的抗抑制物突變體,將任意2種或3種突變體進(jìn)行原生質(zhì)融合,所產(chǎn)生的雜交株,類胡蘿卜素的形成能力比親本和野生型高3倍。細(xì)胞融合技術(shù)不僅可以提高物種變異頻率,而且可以縮短育種周期,拓寬育種領(lǐng)域,提高育種水平,因此細(xì)胞融合技術(shù)將是微藻育種的一種新型、高效的技術(shù)。隨著原生質(zhì)制備方法以及微藻分子遺傳學(xué)研究的深入,細(xì)胞融合技術(shù)將會(huì)被廣泛的應(yīng)用。4重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)近年來,微藻基因工程的研究取得了許多進(jìn)展,研究表明在微藻中表達(dá)重要的蛋白、多肽甚至次生產(chǎn)物合成酶體系,通過分子生物學(xué)技術(shù)阻斷或修飾代謝途徑,就能創(chuàng)制具有商業(yè)價(jià)值的工程藻株和開發(fā)高價(jià)值微藻產(chǎn)品。秦京東等將含有Anabaenasp.PCC7120反義glnA基因片段的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pDC-ATGS,通過同源重組將外源DNA定位整合到單細(xì)胞藍(lán)藻聚球藻染色體上,經(jīng)過抗菌素篩選,獲得1種高效泌氨的突變種,將該突變株固定化培養(yǎng)9天后泌氨活性比自由生活的野生藻高156倍,光系統(tǒng)的活性提高44%。Kawata等將鮭魚生長(zhǎng)激素基因,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入藍(lán)藻SynechococcusPCC7002細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因藻的表達(dá)。利用基因工程進(jìn)行新藻種的選育具有目標(biāo)明確,針對(duì)性強(qiáng)等特點(diǎn),但其安全性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)于微藻基因工程的研究還處于初步階段,當(dāng)前已轉(zhuǎn)化的微藻種類還較少,主要原因是外源基因或經(jīng)體外修飾后的內(nèi)源基因?qū)胛⒃搴蟛荒苓M(jìn)行基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因微藻發(fā)生基因沉默是當(dāng)前要解決的主要問題,同時(shí)在理解與掌握基因的表達(dá)機(jī)制上也同樣有很多工作要做,但隨著對(duì)各種微藻遺傳特性研究的開展,仍有理由相信基因工程在微藻育種中將發(fā)揮更加重要的作用。5困境生理研究葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)以植物體內(nèi)葉綠素作為天然探針,包含豐富的光合作用信息,極易受逆境的影響,是快速、靈敏和無損傷的研究和測(cè)定逆境對(duì)植物光合作用的理想方法。葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科研,尤其是在鑒定作物的耐逆境能力應(yīng)用日益漸多,其原理是逆境脅迫對(duì)光合作用產(chǎn)生影響從而改變?nèi)~綠素?zé)晒鈪?shù)。近年來,葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定技術(shù)也逐漸應(yīng)用于微藻逆境生理研究之中,主要集中在逆境脅迫對(duì)微藻葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的影響、微藻對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)等方面。許多研究表明,從熒光參數(shù)Fv/Fm,Fv/Fo,φPSⅡ,ETR,qP和NPQ的變化趨勢(shì)可以說明,逆境下不同微藻品種其PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率,PSⅡ的潛在活性、PSⅡ?qū)嶋H的光能捕獲效率、電子傳遞、光合氧化等過程是不同的,因此,可以利用測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化,來評(píng)價(jià)不同微藻品種對(duì)逆境的適應(yīng)性,并可作為篩選抗逆品種的1個(gè)參考指標(biāo),但因該方面的研究較少,能否直接用作抗逆鑒定指標(biāo),尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前作者所在實(shí)驗(yàn)室正利用德國(guó)Walz公司產(chǎn)葉綠素?zé)晒鈨x(Water-PAM)開展這方面的研究工作,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在不同鹽度條件下,塔胞藻的熒光參數(shù)Fv/Fm,Fv/Fo,φPSⅡ和ETR與細(xì)胞密度均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系;高溫脅迫下三角褐指藻和纖細(xì)角毛藻的熒光參數(shù)Fv/Fm,Fv/Fo,φPSⅡ,ETR和qP均明顯降低,并且隨著脅迫溫度的升高,脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),下降幅度也逐步增大,而高溫脅迫停止后,上述兩種藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)都有不同程度的恢復(fù)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都說明葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)作為微藻品種的篩選指標(biāo)有一定的可行性。