抗甲霜靈辣椒疫霉菌株生物學(xué)性狀測定及生物學(xué)性狀分析

抗甲霜靈辣椒疫霉菌株生物學(xué)性狀測定及生物學(xué)性狀分析

甲霜靈是一種具有獨(dú)特植物感染特性的內(nèi)毒唑酮衍生物，可以保護(hù)和治療。這是預(yù)防和治療植物感染最常用的藥物之一。甲霜靈的作用機(jī)制主要是通過抑制疫霉菌的RNA聚合酶Ⅰ的活性,從而抑制疫霉菌RNA的合成。甲霜靈屬于特異性位點(diǎn)抑制劑,對(duì)病原菌作用位點(diǎn)單一,因此,病原菌易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性,且抗藥性的發(fā)生速度快、抗性水平較高。甲霜靈對(duì)疫霉菌生物學(xué)性狀的影響較為復(fù)雜,前人研究表明,從室內(nèi)外獲得的疫霉菌抗甲霜靈突變株,除抗藥性發(fā)生變異外,其它生物學(xué)性狀也可能發(fā)生變異。但不同疫霉種或不同研究所得的結(jié)果差異較大,如惡疫霉Phytophthoracactorum和大雄疫霉P.megasperma抗甲霜靈突變株的生長速度顯著小于野生型親本,而大雄疫霉苜蓿?；蚉.megaspermaf.sp.medicaginis的抗藥性菌株生長速度與野生型敏感親本菌株相似;苧麻疫霉P.boehmeriae抗甲霜靈突變株的生長速率、生長溫度范圍、游動(dòng)孢子囊產(chǎn)生量和對(duì)棉苗的致病力等性狀與其親本均無顯著差異;致病疫霉P.infestans抗甲霜靈菌株產(chǎn)生孢子囊的能力強(qiáng)于野生型敏感親本。目前,關(guān)于甲霜靈對(duì)辣椒疫霉P.capsici生物學(xué)性狀的影響僅國外有少量報(bào)道。Bower&Coffey報(bào)道抗甲霜靈辣椒疫霉菌株的致病力、孢子囊產(chǎn)生能力和適生性均強(qiáng)于敏感菌株;Bruin&Edington研究認(rèn)為,抗甲霜靈辣椒疫霉菌株的菌絲生長速率、適生力等較敏感菌株弱;而Café-Filho&Ristaino研究認(rèn)為,辣椒疫霉抗精甲霜靈(mefenoxam)菌株的菌絲生長速率、孢子囊產(chǎn)生能力、毒力和適生性等與敏感菌株均無差別。國內(nèi)迄今尚無相關(guān)報(bào)道。據(jù)作者等研究,安徽地區(qū)已有一定比例的辣椒疫霉菌株對(duì)甲霜靈產(chǎn)生了抗性。然而,這些抗性菌株的生物學(xué)特性的變化尚不清楚。為此,本試驗(yàn)對(duì)田間自然產(chǎn)生及室內(nèi)篩選獲得的抗甲霜靈辣椒疫霉菌株的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢能力、生長速率、致病力等生物學(xué)性狀進(jìn)行了研究,以期明確甲霜靈對(duì)辣椒疫霉生物學(xué)性狀的影響及辣椒疫霉抗甲霜靈菌株的適生性。1材料和方法1.1菌株的篩選和生產(chǎn)辣椒疫霉P.capsici菌株DS4和YS7分別從安徽碭山縣和潁上縣的辣椒田間采集分離,對(duì)甲霜靈具有抗性,EC50值分別為25.4721μg/mL和12.3905μg/mL;菌株HX2和HN3分別是從安徽省和縣和淮南市采集分離的辣椒疫霉菌株,對(duì)甲霜靈敏感,EC50值分別為0.2046μg/mL和0.2147μg/mL;菌株HX22和HN31分別是以HX2和HN3菌株為親本經(jīng)室內(nèi)篩選獲得的抗甲霜靈突變株,EC50值分別為287.3582μg/mL和376.2863μg/mL。供試孔雀石綠(malachitegreen,C23H25ClN2)由天津市巴斯夫化工有限公司生產(chǎn);91.2%甲霜靈(metalaxyl)原藥,江蘇寶靈化工公司生產(chǎn);辣椒、西葫蘆、南瓜、番茄、茄子等果實(shí),市購。1.2方法1.2.1厚垣藥物釋放率測定菌落形態(tài):供試菌株在CA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)3天,從菌落邊緣取直徑5mm的菌絲塊,分別移至空白CA平板和含有5μg/mL甲霜靈的CA平板中央,25℃下黑暗培養(yǎng)5天,觀察、記錄病原菌菌落、菌絲形態(tài)特征;在CA平板上單株培養(yǎng)2周以上,觀察是否產(chǎn)生卵孢子;在36℃高溫、16℃低溫、25℃常溫下交替培養(yǎng)各1周,觀察是否產(chǎn)生厚垣孢子。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。孢子囊形態(tài)及產(chǎn)孢能力:供試菌株在CA平板上25℃黑暗培養(yǎng)4天后,沿菌落邊緣取直徑5mm菌碟10個(gè)于20mL皮氏液中,25℃下光照培養(yǎng)24h。挑取已產(chǎn)生大量孢子囊的菌絲塊于試管中,加水1mL,用力搖晃5min,鏡檢孢子囊脫落情況。隨機(jī)測量20個(gè)孢子囊的大小及乳突高度,計(jì)算孢子囊長寬比。吸取孢子囊懸浮液5μL滴于載玻片上,于10×16倍顯微鏡下鏡檢,計(jì)數(shù)孢子囊總數(shù),重復(fù)5次。計(jì)算平均游動(dòng)孢子囊數(shù)量/mL。取20μL無菌水于載玻片上,挑取少許帶游動(dòng)孢子囊的菌絲在水中分散,于顯微鏡下隨機(jī)固定1個(gè)視野,每隔10min觀察一次孢子囊釋放游動(dòng)孢子情況,計(jì)數(shù)孢子囊總數(shù)和已釋放游動(dòng)孢子的孢子囊數(shù),最后計(jì)算孢子囊的釋放率,重復(fù)5次。參照彭化賢等方法將同期配制的孢子囊懸浮液靜置1.5~2h后,取5μL菌液滴于血球計(jì)數(shù)器上,鏡檢,計(jì)數(shù)游動(dòng)孢子總數(shù)和萌發(fā)的游動(dòng)孢子數(shù),計(jì)算萌發(fā)率。重復(fù)5次。1.2.2溫度對(duì)菌落直徑的影響將供試菌株接種于CA平板上,25℃黑暗下培養(yǎng)4天,用直徑4mm的打孔器沿菌落邊緣打取菌碟,轉(zhuǎn)接到CA平板培養(yǎng)基的中央,分別在8、12、16、20、24、28、32、36、40℃下恒溫培養(yǎng)96h,測量菌落直徑,每處理3次重復(fù)。根據(jù)菌絲的生長情況和菌落直徑的大小確定菌絲生長的最低、最適和最高溫度。1.2.3生長抑制率測定對(duì)孔雀石綠的敏感性:從CA培養(yǎng)基上取直徑為5mm的供試菌株菌絲塊,接種于含孔雀石綠濃度分別為100、10、1.25、1和0.1μg/mL的CA平板中央,以不含孔雀石綠的CA平板為對(duì)照,25℃下培養(yǎng)3天,測定菌落直徑,計(jì)算菌絲生長受抑制程度,每處理3次重復(fù)。對(duì)淀粉的利用能力測定:采用Ho&Foster含淀粉固體培養(yǎng)法,將供試菌株于25℃下在CA平板上培養(yǎng),4天后測定菌落直徑(D)和淀粉水解圈直徑(d),用淀粉水解指數(shù)(hydrolysisindex,HI)衡量各菌株利用淀粉的能力。HI(%)=(d/D)×100。1.2.4病原菌的培養(yǎng)將供試菌株分別在CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天,沿菌落邊緣處打取直徑為4mm的菌餅。選擇新鮮、整齊、健康的辣椒、西葫蘆、南瓜、番茄、茄子等果實(shí),用針束(4根小號(hào)昆蟲針扎在一起)在果實(shí)表面輕刺,然后將菌餅反貼于傷口處,再用脫脂棉球蘸水保濕,置于26℃的培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng),48h后觀察各果實(shí)發(fā)病情況,84h后測量各處理的病斑最大直徑。以空白CA培養(yǎng)基塊為對(duì)照,每處理重復(fù)3次。1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,采用SSR法進(jìn)行多重比較。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)特性2.1.1抗甲霜靈突變株與分子鑒定株h2c、hn3的形態(tài)特征6個(gè)供試菌株在空白CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天后,菌落白色,HN3、HN31和DS4呈絨毛狀,外緣整齊平滑,而HX2、HX22和YS7呈花瓣?duì)罨蚍派錉顢U(kuò)展,其中抗甲霜靈突變株HX22和HN31分別與其親本菌株HX2和HN3形態(tài)相似。在含甲霜靈的CA平板上,抗甲霜靈菌株DS4、YS7、HN31和HX22的菌落形態(tài)與在空白CA培養(yǎng)基上一致,而對(duì)甲霜靈敏感的HN3和HX2菌株在含5μg/mL甲霜靈的CA平板上均不能生長。2.1.2抗甲霜靈菌株的前培養(yǎng)液抗甲霜靈菌株DS4、YS7、HX22和HN31與甲霜靈敏感菌株HX2和HN3所產(chǎn)生的孢子囊形態(tài)相似,均為淡褐色,多卵圓形、近球形或長橢圓形,不同菌株的孢子囊大小、柄長和乳突因發(fā)育程度不同有明顯差異,但平均長39.8~44.8μm、寬28.4~31.7μm,長寬比為1.36~1.47,菌株間差異不明顯;孢子囊乳突明顯,絕大多數(shù)為單乳突,偶見雙乳突,乳突高度為2.6~7.4μm,平均為3.9~4.4μm;孢子囊易脫落,孢囊梗形態(tài)與菌絲差異不大,長柄,長度為18.6~60.1μm,平均為35.0~38.4μm(表1)。抗甲霜靈菌株DS4、YS7、HX22和HN31與甲霜靈敏感菌株HX2和HN3孢子囊產(chǎn)生量分別為9600、10800、11000、11600、12600和13000個(gè)/mL;孢子囊釋放率分別為65.9%、68.4%、62.6%、66.6%、64.3%和61.3%;游動(dòng)孢子萌發(fā)率分別為42.1%、40.6%、42.0%、35.3%、38.5%和39.8%。經(jīng)方差分析,各菌株間孢子囊產(chǎn)生量、孢子囊釋放率、游動(dòng)孢子萌發(fā)率等差異均不顯著;所有供試菌株單株培養(yǎng)2周后均未發(fā)現(xiàn)卵孢子,高溫-低溫-常溫交替培養(yǎng)3周后未發(fā)現(xiàn)厚垣孢子。說明抗甲霜靈菌株的產(chǎn)孢能力與甲霜靈敏感菌株相似。2.2生長速率和菌落直徑分別測定了不同溫度下各菌株生長速率和同一溫度下不同菌株生長速率,各菌株在24~28℃下的生長速率均顯著快于其它溫度,平均達(dá)10.8mm/天左右,12~16℃和36℃條件下,各菌株生長速率較慢,顯著低于其它溫度;同一溫度下各菌株的生長速率差異未達(dá)顯著水平。說明抗甲霜靈菌株DS4、YS7、HX22和HN31的生長速率與甲霜靈敏感菌株HX2和HN3相似(表2)。供試的6個(gè)菌株在12~36℃范圍內(nèi)均可生長,其中最適生長溫度為24~28℃,在24℃時(shí)菌落直徑最大,培養(yǎng)4天后平均達(dá)47.5mm,28℃條件下菌落直徑平均為47.12mm;各菌株在8℃和40℃下均不能生長。表明抗甲霜靈菌株DS4、YS7、HX22和HN31的生長溫度范圍與甲霜靈敏感菌株HX2和HN3相似。2.3抗甲霜醇免疫球蛋白的生理生化特性2.3.1孔雀石綠假設(shè)計(jì)供試菌株在含孔雀石綠0.1μg/mL的CA培養(yǎng)基上均能正常生長,抑制率為2.2%~10.0%,在含1.00μg/mL的孔雀石綠CA上仍能生長,且不同菌株的菌落直徑間無顯著差異。隨著孔雀石濃度的增加,各菌落的直徑逐漸減小,在1.25μg/mL濃度下,孔雀石綠對(duì)各菌株的抑制率為52.6%~72.7%;在10μg/mL濃度下,菌株YS7和HX2分別被抑制94.8%和91.6%,其余4個(gè)菌株則完全被抑制;在100μg/mL濃度下各菌株均不能生長。說明抗甲霜靈菌株對(duì)孔雀石綠的敏感性與敏感菌株相似(表3)。2.3.2菌株對(duì)淀粉的利用能力供試的6個(gè)菌株利用淀粉的能力有較大差異,其中菌株HX2、HX22和YS7能夠有效地利用淀粉作為碳源,水解指數(shù)分別為0.93、0.94和0.95,而菌株DS4、HN3和HN31對(duì)淀粉的利用能力較差,水解指數(shù)分別為0.30、0.18和0.21。雖然不同菌株對(duì)淀粉的利用能力存在差異,但抗甲霜靈菌株HX22和HN31分別與其親本HX2和HN3的水解指數(shù)相近,說明甲霜靈沒有改變菌株對(duì)淀粉的利用能力。2.4對(duì)不同果實(shí)的致病力檢測用供試菌株分別接種辣椒、西葫蘆、南瓜、番茄、茄子等植物果實(shí),3天后被接種果實(shí)均產(chǎn)生明顯病斑。不同種類果實(shí)上的病斑直徑相差較大,其中西葫蘆上的病斑直徑平均達(dá)37.78mm,而番茄上僅18.47mm,說明辣椒疫霉對(duì)不同種類植物果實(shí)的致病力存在差異。進(jìn)一步對(duì)不同菌株在同一種果實(shí)上的病斑直徑和同一菌株在不同種果實(shí)上的病斑直徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,不同菌株對(duì)同一種蔬菜果實(shí)的致病力存在差異,如HX2菌株對(duì)辣椒的致病力顯著強(qiáng)于YS7、HN3和HN31菌株,而其對(duì)南瓜的致病力則顯著弱于YS7、DS4、HN3和HN31菌株,且均達(dá)極顯著水平;同時(shí),同一菌株對(duì)不同果實(shí)的致病力也存在明顯差異,如YS7菌株對(duì)南瓜的致病力顯著強(qiáng)于對(duì)辣椒、番茄和茄子的致病力,而DS4菌株對(duì)西葫蘆的致病力顯著強(qiáng)于對(duì)其它4種果實(shí)的致病力;HX2與HX22對(duì)同一種植物果實(shí)的致病力差異始終未達(dá)顯著水平,HN3與HN31亦然,說明抗甲霜靈菌株HX22和HN31與甲霜靈敏感菌株HX2和HN3的寄主范圍和對(duì)植物果實(shí)的致病力相似(表4)。3主要生物性狀及抗性突變株的獲得Cafue7b0-Filho&Ristaino研究表明,辣椒疫霉抗精甲霜靈菌株的適生性與敏感菌株無明顯差別。雖然使用的是精甲霜靈而非普通的甲霜靈,但精甲霜靈是外消旋體甲霜靈中的一種(R體),具有與普通甲霜靈相同的作用機(jī)制,只是活性更高,因此抗精甲霜靈菌株的研究結(jié)果同樣適用于抗甲霜靈菌株。本研究表明,辣椒疫霉抗甲霜靈突變株的形態(tài)特征均與敏感菌株相似,主要生物學(xué)性狀與敏感菌株均無顯著差異,說明其生物學(xué)性狀未因辣椒疫霉對(duì)甲霜靈產(chǎn)生抗性突變而改變。結(jié)果與Cafue7b0-Filho&Ristaino的觀點(diǎn)相一致。據(jù)報(bào)道,美國特拉華、馬里蘭、新澤西、卡羅萊納以及智利、意大利、中國江西等地辣椒疫霉群體內(nèi)均檢測出一定比例的抗甲霜靈或精甲霜靈菌株。作者等之前研究發(fā)現(xiàn),在施用甲霜靈次數(shù)頻繁、年限較長的安徽和縣、碭山等地區(qū),已經(jīng)出現(xiàn)抗甲霜靈的辣椒疫霉菌株,例如DS4和YS7。在本研究中,作者以野生型敏感菌株HX2和HN3為親本,經(jīng)室內(nèi)藥物篩選分