云錦杜鵑菌根真菌共生培養(yǎng)研究

云錦杜鵑菌根真菌共生培養(yǎng)研究

細(xì)菌根是自然界常見的植物共生現(xiàn)象。這是植物在長(zhǎng)期生存過(guò)程中與細(xì)菌根一起發(fā)展的結(jié)果。根據(jù)真菌、植物種類及其形成的特點(diǎn)，細(xì)菌根分為外生菌根、內(nèi)生菌根和內(nèi)生菌根。內(nèi)生菌根包括泡袋菌根、杜鵑菌根、蘭科菌根等。結(jié)果表明，細(xì)菌根能促進(jìn)主要植物根系在土壤中的礦質(zhì)元素的吸收，提高主要植物根系對(duì)根系的侵蝕強(qiáng)度，提高植物對(duì)干旱、高溫和重金屬的抗性。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，許多樹種通過(guò)嫁接細(xì)菌根獲得了顯著的嫁接效果，創(chuàng)造了樹種的成活率和再植效率。杜鵑花科植物除野草莓、漿果鵑屬(Arbutus),熊果屬(Arctostaphylos)外,都有明顯的杜鵑花類菌根共生.菌根對(duì)杜鵑花類植物的營(yíng)養(yǎng)吸收以及增強(qiáng)對(duì)逆境因子的抗性等方面具有重要作用.人工接種菌根真菌對(duì)杜鵑花科植物的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用.杜鵑花類菌根提高植物適應(yīng)性的潛能方面的相關(guān)研究受到國(guó)外的廣泛關(guān)注.但我國(guó)對(duì)杜鵑花類菌根的研究尚未見報(bào)道.云錦杜鵑(RhododendronfortuneiL.)是杜鵑花科杜鵑花屬常綠灌木,廣泛分布于我國(guó)浙江、江西、福建、廣東、廣西、湖南等地,生于海拔400-1900m山林間.其觀賞價(jià)值高且抗性強(qiáng),在歐美杜鵑花育種史上占有重要地位,也是國(guó)內(nèi)一些山區(qū)森林公園的主要觀賞樹種.但是云錦杜鵑引種后生長(zhǎng)不良等問(wèn)題一直沒(méi)有得到解決.本文通過(guò)對(duì)菌根真菌接種方法進(jìn)行篩選,研究菌根對(duì)云錦杜鵑幼苗生長(zhǎng)的影響.1材料和方法1.1菌株和培養(yǎng)基植物材料:云錦杜鵑種子,采自廬山自然保護(hù)區(qū).菌株:19號(hào)、23號(hào)和24號(hào)菌株(自野生云錦杜鵑根系中分離得到)和D菌株(德國(guó)INOQ公司提供).接種菌劑:菌株在MMN培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)15d.栽培基質(zhì):草炭和蛭石(均過(guò)1mm的篩)以等體積混合而成.培養(yǎng)基:MMN培養(yǎng)基.1.2方法1.2.1酒精振蕩和培養(yǎng)水脂質(zhì)用紗布包好大約200粒種子,放自來(lái)水中沖洗12h;以75%(體積分?jǐn)?shù))的酒精振蕩40-60s;用10%(體積分?jǐn)?shù))的84消毒液消毒15min,無(wú)菌水沖洗5至6遍;然后播種在水瓊脂的培養(yǎng)基上,光照12h,放置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi);15d后發(fā)芽,長(zhǎng)出的第1片真葉用于接種.1.2.2栽培基質(zhì)的制備采用以下3種接種方法.方法1——雙層基質(zhì)接種法:底層為MMN培養(yǎng)基,上層為0.5-1cm濕潤(rùn)的栽培基質(zhì).方法2——單層基質(zhì)接種法:基質(zhì)為MMN營(yíng)養(yǎng)液和栽培基質(zhì)混合.方法3——單層基質(zhì)接種法:基質(zhì)為少量的栽培基質(zhì)混入MMN培養(yǎng)基中.每瓶接種菌量為4mm的菌塊4塊,營(yíng)養(yǎng)水平相同,栽培小苗5-6棵,每處理5瓶,并設(shè)置空白對(duì)照.接種后的幼苗放在25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)90d..1.2.3幼苗萌發(fā)率的測(cè)定接種3個(gè)月后檢測(cè)菌根真菌侵染率.采用錐蟲藍(lán)染色法,在40倍雙目解剖鏡下取5-6個(gè)視野對(duì)侵染率進(jìn)行估測(cè)統(tǒng)計(jì).試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定幼苗苗高、葉片數(shù)、主根數(shù)、根長(zhǎng)、葉綠素、干重.葉綠素采用分光光度計(jì)法測(cè)定.干重即在室溫下自然風(fēng)干后達(dá)到的恒重.采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析.2結(jié)果與分析2.1確定使用方法1和2接種的育苗率,采用方法2接種的或方法2接種的或方法2接種的或方法2接種的或從表1可知:不同菌株之間的侵染率差異不顯著,但不同接種方法間侵染率差異較大,僅24號(hào)菌株采用方法1接種的幼苗侵染率為46%(略低于50%),其它各菌株采用方法1和方法2接種的侵染率都在50%-60%;采用方法3接種的侵染率較低,都低于20%;方法1、2與方法3之間的侵染率差異極顯著.2.2云錦采用方法2接種云錦松茸幼苗的顯著性分析采用不同方法接種4個(gè)菌株對(duì)云錦杜鵑幼苗生長(zhǎng)的影響見表2.從表2可知:接種方法對(duì)云錦杜鵑幼苗的苗高、葉片數(shù)、主根數(shù)、根長(zhǎng)、干重、葉綠素含量的影響均有顯著差異(圖1).如采用方法2,19號(hào)菌株的平均苗高、葉片數(shù)、根長(zhǎng)、葉綠素、干重分別比對(duì)照增長(zhǎng)99.23%、29.75%、59.70%、42.80%、141.9%.顯著性方差分析結(jié)果見表3.19號(hào)菌株采用方法2接種的幼苗的苗高、根長(zhǎng)、葉綠素、干重與采用方法1、3的差異均達(dá)極顯著水平.采用方法1接種19號(hào)菌株的云錦杜鵑幼苗的苗高、主根數(shù)、根長(zhǎng)、葉綠素、干重與采用方法3接種的也有極顯著差異.采用方法2接種23號(hào)菌株的幼苗,其葉綠素和干重2個(gè)指標(biāo)與采用方法1、3接種的差異達(dá)極顯著水平.方法1與方法3也具有極顯著差異(表4).采用方法1、2接種24號(hào)菌株的幼苗,其苗高、根長(zhǎng)、葉綠素3個(gè)指標(biāo)與采用方法3的差異極顯著.各個(gè)指標(biāo)顯著性方差分析結(jié)果見表5.采用方法2接種D菌株的幼苗,其葉綠素和干重與采用方法1和方法3接種的差異極顯著(表6).可見方法2為3種接種方法中最佳的接種方法,方法1次之,方法3最差.2.34云錦采用5種方法對(duì)云錦采用苗高、葉綠素、根長(zhǎng)和總生物量的促進(jìn)作用從表7可知,在無(wú)菌條件下4個(gè)菌株對(duì)云錦杜鵑幼苗生長(zhǎng)均有明顯的促進(jìn)作用,但不同菌株的作用效果有差異,其中19號(hào)菌株對(duì)云錦杜鵑幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)效果最顯著.采用方法2接種19號(hào)菌株的幼苗,幼苗的苗高、葉綠素、干重、根長(zhǎng)、主根數(shù)分別比對(duì)照增長(zhǎng)99.23%、42.80%、141.9%、59.70%、81.74%,差異均達(dá)極顯著水平.所以19號(hào)菌株對(duì)云錦杜鵑幼苗的苗高、葉綠素、根系及總生物量的增長(zhǎng)均有顯著的促進(jìn)作用.采用方法2接種23號(hào)菌株幼苗,其根長(zhǎng)及干重分別比對(duì)照組增長(zhǎng)31.34%、83.87%.采用同種方法接種23號(hào)菌株對(duì)云錦杜鵑幼苗的根系生長(zhǎng)和總生物量增長(zhǎng)的促進(jìn)作用比接種19號(hào)菌株的弱;采用同種方法接種24號(hào)菌株的幼苗的苗高及主根數(shù)量分別比對(duì)照增長(zhǎng)43.85%、72.48%.D菌株幼苗苗高及主根數(shù)量分別比對(duì)照增長(zhǎng)40%、99.73%,24號(hào)和D菌株對(duì)促使云錦杜鵑幼苗苗高增長(zhǎng)和主根數(shù)增加的效果顯著.方差分析結(jié)果見表8.3結(jié)論和討論3.1接種方法的選擇采用3種方法接種的云錦杜鵑幼苗菌根侵染率有差異,但各菌株都以采用方法2接種的幼苗菌根侵染率最高,幼苗各指標(biāo)平均增幅也最大.表明菌根真菌對(duì)宿主生長(zhǎng)的促進(jìn)效應(yīng)與菌根感染率呈正相關(guān),與其它菌根真菌的接種效應(yīng)一致.方法2采用基質(zhì)栽培,透氣性較其它2種方法好,有利于菌株和植物根系的生長(zhǎng),因此獲得較高的侵染率和良好的接種效應(yīng).方法1的接種基質(zhì)上層是栽培基質(zhì),下層為MMN培養(yǎng)基,菌絲基本集中在下層培養(yǎng)基上生長(zhǎng),不利于菌絲侵染上層植株根系.方法3的培養(yǎng)基質(zhì)主要為MMN培養(yǎng)基,透氣性差,不利于菌絲和植物根系的生長(zhǎng),因此植物根系侵染率低,生長(zhǎng)勢(shì)較差.杜鵑花科植物的根系細(xì)弱,對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)的要求高,因此對(duì)接種方法的選擇和基質(zhì)的篩選十分重要.3.2云錦松茸幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)4個(gè)菌株對(duì)云錦杜鵑幼苗的苗高、葉片數(shù)、主根數(shù)、根長(zhǎng)、葉綠素、干重及總生物量均有顯著的促進(jìn)效應(yīng),但菌株之間的接種效應(yīng)有差異.這與利用外生菌根真菌、AM菌根真菌菌株接種效應(yīng)的研究結(jié)果一致.19號(hào)菌株對(duì)云錦杜鵑幼苗的苗高、葉綠素、根系及總生物量的增長(zhǎng)均有顯著的促進(jìn)作用;23號(hào)菌株對(duì)幼苗的促進(jìn)作用主要表現(xiàn)為根數(shù)量和總生物量的增加;24號(hào)和D菌株對(duì)云