我國佛手種質(zhì)資源保存研究

我國佛手種質(zhì)資源保存研究

水生佛手柑屬于四周科。它以干燥的果實(shí)而聞名。它對肝臟、理氣和胃痛也有效。它不僅是中國重要的原材料，而且具有很高的觀賞價(jià)值，對開發(fā)和利用具有很高的前景。佛手在我國一般無種子,且種內(nèi)變異較大,病害嚴(yán)重,生產(chǎn)上通常采用扦插和嫁接繁殖,長期的無性繁殖,病害逐代傳遞,導(dǎo)致種質(zhì)退化,優(yōu)良種質(zhì)處于瀕危。因此,佛手種質(zhì)保存對佛手資源的可持續(xù)利用具有重要意義。常規(guī)保存佛手種質(zhì)的方法需要大量的人力和財(cái)力,易受氣候、栽培條件、病蟲害的影響,而且長期保存過程中會發(fā)生變異,導(dǎo)致優(yōu)良種質(zhì)丟失。超低溫保存是植物種質(zhì)長期穩(wěn)定保存的較理想方法,其中玻璃化凍存法易于操作,成活率高,具有很大的應(yīng)用潛力。目前已成功保存了柑桔、懷山藥、柿等多種植物,但尚未見到佛手種質(zhì)資源保存的報(bào)道。佛手成年材料離體培養(yǎng)較為困難,本實(shí)驗(yàn)對佛手莖尖進(jìn)行玻璃化超低溫保存方法的探索和研究,然后通過莖尖微嫁接獲得再生完整植株,并對再生植株進(jìn)行黃龍病病原的PCR檢測,初步建立起玻璃化超低溫保存的方法,為佛手種質(zhì)資源的長期保存奠定技術(shù)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1成年樹莖尖的鑒定所用的材料為佛手CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle(CMS)成年樹莖尖,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)張丹雁教授鑒定。1.2方法1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取佛手成年樹莖尖,自來水沖洗后用0.1%氯化汞溶液滅菌6min,無菌蒸餾水沖洗4～5次,在無菌條件下切取6～8mm的莖尖,接種在含0.5%二甲基亞砜(DMSO)和5%蔗糖的MS培養(yǎng)基上,于20℃和光照1000lx(12h/d)下預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)。1.2.2裝載與脫水:切取不同長度預(yù)培養(yǎng)后的莖尖,轉(zhuǎn)移到1.8mL冷凍管中,每管10～20個(gè)莖尖。室溫下用60%PVS2(0.15mol/L蔗糖液體培養(yǎng)基-PVS2溶液40:60)溶液預(yù)處理不同時(shí)間,再在0℃下用PVS2(30%甘油,15%乙二醇,15%DMSO,0.4mol/L的蔗糖)進(jìn)行玻璃化處理不同時(shí)間,移去原液,裝入新鮮的PVS2后,迅速投入液氮中,保存24h以上。1.2.3莖尖成活率、再生率測定從液氮中取出冷凍管,分別于4～50℃水浴解凍(凍存管中的PVS2剛好全部呈液態(tài)狀)后吸去PVS2,再轉(zhuǎn)到室溫下用1.2mol/L蔗糖+MT基本培養(yǎng)基洗滌2次,每次10min。莖尖成活率檢測:采用TTC法檢測莖尖成活率。莖尖再生率檢測:采用已建立的佛手莖尖微嫁接方法,并加以改進(jìn)。將超低溫保存后的莖尖嫁接到黑暗培養(yǎng)的檸檬砧木上,移入以MT為基本培養(yǎng)基,附加6-BA0.5mg/L和7.5%的蔗糖的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng);培養(yǎng)溫度為(26±1)℃,每天光照12h,光照強(qiáng)度為2000lx。一般每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理,嫁接的苗數(shù)為15個(gè)。觀察嫁接苗的長勢,記錄恢復(fù)生長的時(shí)間及30d后嫁接成活率。再生率=(玻璃化超低溫保存后的莖尖嫁接苗成活數(shù)/保存的總莖尖數(shù))×100%。本試驗(yàn)為單因素試驗(yàn),每次處理10～15個(gè)莖尖,重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Duncan新復(fù)極差法數(shù)據(jù)分析。1.2.4引物與pcr擴(kuò)增采用上海申能博彩公司的3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒提取樣品總DNA。紫外分光光度法檢測DNA純度和濃度,并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結(jié)果。根據(jù)法國Villechanoux教授發(fā)表的黃龍病部分DNA序列(基因序號碼為M94319)設(shè)計(jì)引物。引物P1(TCTGTTTTCTTCGAGGTTGGTGAG)與黃龍病DNA序列的37～60位核苷酸同源,引物P2(ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG)與462～485位核苷酸互補(bǔ),PCR產(chǎn)物的分子量為570bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng):反應(yīng)體系為10×buffer緩沖液5μL,dNTPs5μL(2mmol/L),MgCl23μL(25mmol/L),Taq酶0.5μL(5U/μL),引物各0.5μL(30μmol/L(,DNA模板100ng,加入滅菌純水至50μL。循環(huán)參數(shù)為94℃5min,隨后94℃1min,55℃1min,72℃1.5min,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。反應(yīng)完畢后,取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳后在凝膠分子成像儀上檢測并拍照記錄。2結(jié)果與分析2.1莖尖預(yù)培養(yǎng)在預(yù)培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),佛手莖尖用低溫鍛煉和山梨醇進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),均未能提高凍后材料的成活率,而用5%DMSO進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),則明顯提高了凍后成活率。莖尖在MS+5%DMSO+5%蔗糖的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)0～72h后,再切取3～4mm左右的莖尖,室溫下60%PVS2預(yù)處理30min,0℃下用PVS2溶液處理60min,投入液氮保存24h后取出,40℃水浴快速化凍,洗滌,檢測成活率及再生率。結(jié)果表明(表1),用5%DM-SO進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)對提高材料凍后成活率和再生率效果明顯。在預(yù)培養(yǎng)初期(0～48h),隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長,成活率和再生率明顯提高,預(yù)培養(yǎng)48h保存的成活率和再生率均達(dá)最高,分別為58.49%和35.30%。這可能是因?yàn)轭A(yù)培養(yǎng)使細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生有利于超低溫保存的變化,使胞內(nèi)保護(hù)性物質(zhì)增多,成活率提高;但預(yù)培養(yǎng)60h后,莖尖變黃較多,成活率明顯下降,可能是較弱的材料受不了DMSO的毒害而死亡,較強(qiáng)壯的材料才能經(jīng)受住DMSO的毒害作用。綜合考慮,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間以48h為好。2.2預(yù)處理和裝復(fù)時(shí)間對成活率的影響據(jù)研究,植物莖尖在用玻璃化溶液(PVS)快速脫水之前,有一個(gè)所謂裝載(Loading)的過程,即用一個(gè)較高濃度的冷凍保護(hù)劑混合液于室溫下預(yù)處理一定時(shí)間,以進(jìn)一步降低組織含水量,避免由于滲透壓變化劇烈對材料所造成的傷害。本試驗(yàn)預(yù)培養(yǎng)48h后的莖尖,室溫下用60%PVS2預(yù)處理不同時(shí)間,0℃下用PVS2處理60min,投入液氮保存24h后取出,40℃水浴快速化凍,檢測成活率及再生率。由表2可以看出,用60%PVS2進(jìn)行裝載,成活率與對照(預(yù)處理0min)相比有較大提高,預(yù)處理時(shí)間30min時(shí)成活率最高,達(dá)69.80%,再生率為42.86%;低于20min,由于裝載時(shí)間過短而未能完全達(dá)到緩沖的作用,材料不易成活;超過40min,則由于裝載液對材料的毒害而使成活率有所下降。預(yù)處理時(shí)間的長短與處理時(shí)的溫度也有一定的關(guān)系,在室溫較低的冬季,處理時(shí)間以30min為好,而在室溫較高的夏季,可適當(dāng)縮短至20min。2.3液氯化液體系制備PVS2處理是玻璃化超低溫保存的關(guān)鍵步驟,其目的是脫去材料中過多的水分,使材料能夠完全達(dá)到玻璃化,減輕在超低溫保存過程中細(xì)胞所受到的傷害。本試驗(yàn)將預(yù)培養(yǎng)的莖尖,室溫下用60%PVS2預(yù)處理30min,再在0℃下用PVS2處理不同時(shí)間,投入液氮保存24h后取出,在40℃水浴快速化凍、洗滌,然后檢測成活率及再生率,結(jié)果見表3。PVS2處理對保存后的莖尖成活率和再生率有明顯的影響,沒有這一步處理,保存后莖尖全部死亡;用PVS2處理80min,可顯著提高成活率和再生率,分別為76.27%和52.38%;當(dāng)處理時(shí)間為100min時(shí),成活率和再生率明顯降低,分別為39.12%和27.27%。這可能是因?yàn)殡S著處理時(shí)間延長,一部分冰凍保護(hù)劑滲透到材料內(nèi),對材料造成傷害。用PVS2處理使莖尖內(nèi)組織進(jìn)一步脫水,一些易形成玻璃化狀態(tài)的分子(DMSO、EG、Gly)很快進(jìn)入到莖尖組織,一旦快速冷凍,莖尖組織形成玻璃化狀態(tài),可以減輕對材料的傷害,從而提高凍存后的成活率和再生率,而選擇低溫(0℃)比在室溫下可以減少保護(hù)劑對材料的傷害。在本試驗(yàn)中,佛手莖尖在0℃下用PVS2處理80min時(shí)獲得了較高的成活率和再生率。2.4莖尖長度對成活率、再生率的影響莖尖大小對脫水的難易影響很大,莖尖大不利于脫水,玻璃化程度不夠而影響成活率,但再生容易;體積小,易于脫水,但不易再生,而且,冷凍保護(hù)劑對材料的毒害較大,從而影響成活率。佛手莖尖預(yù)培養(yǎng)后,分別切取2～3mm、3～4mm、4～5mm、5～6mm的莖尖,室溫下用60%PVS2預(yù)處理30min,再在0℃下用PVS2處理80min,投入液氮保存24h后取出,在40℃水浴快速化凍、洗滌,然后檢測成活率及再生率。由圖1可知,不同大小的莖尖其成活率和再生率差異很大。莖尖長度在3～4mm,成活率和再生率均較高,分別為81.25%和52.94%,而莖尖長度過大或過小時(shí)成活率和再生率均有所下降。因此,在進(jìn)行佛手莖尖超低溫保存時(shí),莖尖大小以3～4mm較合適。2.5化凍溫度對成活率的影響化凍溫度是影響材料超低溫保存效果的重要環(huán)節(jié),本試驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)化凍溫度(4、20、30、40、50℃),結(jié)果表明(圖2),隨著化凍溫度的升高,成活率相應(yīng)增高,但過高的化凍溫度會導(dǎo)致成活率下降,用40℃水浴化凍佛手莖尖凍后成活率明顯較其他組別高,故化凍溫度采用40℃較好。2.6超低溫保存植株葉片形態(tài)觀察超低溫保存后的莖尖嫁接到砧木上后,1d后部分莖尖開始變黃,12d后,有些莖尖仍保持綠色,開始恢復(fù)生長,30d后成活苗可長出5～6片新葉,葉色淺綠色。而常溫嫁接3d后部分莖尖開始變黃,7d后保持綠色的恢復(fù)生長,30d后成活苗可長出8～10片新葉,葉色較深。超低溫再生苗與常溫嫁接苗在植株和葉片的形態(tài)上無差異,僅在生長勢、株高、葉片數(shù)和莖節(jié)長度上有差異,但不顯著,這可能是因?yàn)槌蜏乇４鎸Σ牧嫌幸欢ǖ膫?其恢復(fù)生長需要一定時(shí)間,也初步表明用玻璃化超低溫保存技術(shù)保存佛手莖尖是合適的。莖尖微嫁接再生植株是通過器官發(fā)生途徑,未經(jīng)過愈傷組織階段,因此發(fā)生變異的機(jī)率很小,理論上能夠保證遺傳資源的穩(wěn)定性。目前,再生植株生長和分化正常,進(jìn)一步遺傳穩(wěn)定性檢測在進(jìn)行中。2.7實(shí)生菌的檢測在98株再生植株中隨機(jī)選取10株進(jìn)行黃龍病病原PCR檢測,以感染黃龍病的甜橙葉片作為正對照,健康一年生檸檬實(shí)生菌作為負(fù)對照,同時(shí)檢測表現(xiàn)黃龍病癥狀的佛手葉片。結(jié)果表明,感染了黃龍病病原的甜橙及表現(xiàn)黃龍病癥狀的佛手,在預(yù)計(jì)的570bp擴(kuò)增出特異的電泳譜帶,而健康檸檬實(shí)生苗及超低溫保存后佛手莖尖微嫁接苗均未擴(kuò)增出特征譜帶(圖3),表明莖尖微嫁接技術(shù)可以脫除佛手黃龍病病原體。3不同植物材料對預(yù)培養(yǎng)的效果目前長期穩(wěn)定保存植物種質(zhì)資源的最好方法是進(jìn)行玻璃化超低溫保存,在液氮低溫下(-196℃),所有的細(xì)胞分裂和代謝活動(dòng)幾乎完全停止,植物材料處于相對穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài),因而從理論上來說,材料保存時(shí)間長短不會影響保存效果,比如櫻桃在液氮中保存1d和10個(gè)月,其保存效果沒有明顯差別。在本課題組實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),佛手莖尖超低溫保存6個(gè)月與保存24h,其成活率和再生率無顯著差異,有關(guān)佛手種質(zhì)資源的長期保存,目前還在深入研究中。超低溫保存前必須經(jīng)過預(yù)培養(yǎng),以提高植物材料的抗凍性,減少或避免冷凍傷害。不同的植物材料,預(yù)培養(yǎng)方式也不相同。柑桔試管苗莖尖超低溫保存中,5%DMSO預(yù)培養(yǎng)3d成活率最高;柿莖尖超低溫保存中,103、171、239g/L蔗糖各1d的效果最好。本研究用5%DMSO和5%蔗糖預(yù)培養(yǎng),明顯提高了凍后成活率。其原因可能是不同材料對預(yù)培養(yǎng)保護(hù)性脫水的“敏感度”不一樣,DMSO屬于滲透性保護(hù)劑,易滲透到細(xì)胞內(nèi)使其脫水不徹底;蔗糖是非滲透大分子物質(zhì),能讓細(xì)胞脅迫脫水,二者組合處理更能達(dá)到保護(hù)性脫水的目的。經(jīng)過超低溫保存的莖尖,TTC法檢測成活率在80%左右,而微嫁接再生率僅52%左右(采用優(yōu)化的莖尖微嫁接方法,一般嫁接成活率可達(dá)75%以上),即再生率低于成活率。這可能是因?yàn)?在進(jìn)行超低溫保存時(shí),保存的材料因受到傷害的程度不同,有些材料完全沒有受到傷害,所以很快就恢復(fù)生長;有的材料受到了稍重的傷