生防菌枯草芽孢桿菌bs2004菌株固體發(fā)酵條件的研究

生防菌枯草芽孢桿菌bs2004菌株固體發(fā)酵條件的研究

本生代草芽是一種嗜熱好氧的桿菌，廣泛存在于自然界。它對人類沒有傷害，也沒有污染環(huán)境。它可以產(chǎn)生各種抗菌素和酶，并具有廣泛的抗菌活性。該菌能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢,有利于芽孢桿菌在環(huán)境中存活、定殖及其生防菌劑的加工、運(yùn)輸。目前,該菌的研究、生產(chǎn)等主要以液體發(fā)酵為主,為解決液體發(fā)酵產(chǎn)生大量廢棄液、造成環(huán)境污染和后續(xù)應(yīng)用生產(chǎn)工序復(fù)雜等問題,針對具有抗病促生作用的枯草芽孢桿菌Bs2004進(jìn)行了固體發(fā)酵條件及干燥方式篩選研究,為枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵工藝研究及其應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1土壤分離、種子培養(yǎng)基配方供試菌種為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis2004),于2004年從德國菜園土壤中分離,通過鑒定并引進(jìn)保存。液體種子培養(yǎng)基配方為:蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl5g、水1L,pH值7.0~7.2。固體發(fā)酵培養(yǎng)基所用原料及試劑:麩皮、米糠、玉米粉、豆粕、谷殼、硫酸銨、尿素、蛋白胨、酵母粉、蔗糖、麥芽糖、阿拉伯糖、木糖等。1.2測試方法1.2.1培養(yǎng)種子取1環(huán)活化的保存菌種于盛有20mL液體種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,混勻,28℃、150r/min培養(yǎng)20h。1.2.2s1004菌株活菌數(shù)與od650值間的相關(guān)性采用分光光度計(jì)法和梯度稀釋平板涂抹法結(jié)合,測定Bs2004菌株活菌數(shù)與OD660值間相關(guān)性,建立含菌量—吸光度值曲線。發(fā)酵結(jié)束,將發(fā)酵固形物稀釋1000倍,測定OD660值,根據(jù)OD值計(jì)算活菌數(shù)。1.2.3活菌數(shù)檢測配制麩皮培養(yǎng)基,滅菌接種培養(yǎng),40h前每隔4h取3個(gè)平行樣,按1.2.2進(jìn)行活菌數(shù)檢測。以時(shí)間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),建立生長曲線。1.2.4接種od.按不同試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素配比固體發(fā)酵培養(yǎng)基,121℃滅菌30min,冷卻后接種OD660=0.476,即1×107cfu/mL的種子液1mL,混勻,32℃恒溫培養(yǎng)24h。1.2.5基質(zhì)對活菌數(shù)的測定分別以麩皮、米糠、玉米粉、豆粕、谷殼單質(zhì)和兩兩等質(zhì)量混合為基質(zhì),稱取10g基質(zhì),加水使其含水量為60%,浸泡1h、滅菌、接種,每處理3次重復(fù),24h后檢測活菌數(shù)。1.2.6接種量檢測取5g麩皮、5g豆粕,分別按含水量50%、55%、60%、65%、70%、75%比例加水,浸泡1h滅菌、接種,每處理3次重復(fù),24h檢測。1.2.7ph值對不同ph值的地層水相互關(guān)系的影響分別用1moL/LHCl和1moL/L的NaOH調(diào)節(jié)水pH值為4~9,0.5為一個(gè)梯度,用不同pH值的水,按含水量65%加入5g麩皮與5g豆粕混合基質(zhì),浸泡1h后滅菌,每處理3次重復(fù),接種培養(yǎng)24h檢測。1.2.8水處理對不同濃度的水的制備取5g麩皮、5g豆粕,加入65%pH值為7.5的水,浸泡1h滅菌,分別置20、24、28、30、32、36、38、40℃培養(yǎng),每個(gè)處理3次重復(fù),24h后檢測。1.2.9碳氮源試劑培養(yǎng)取5g麩皮、5g豆粕,加入65%pH值為7.5、分別含有5%的硫酸銨、尿素、蛋白胨、酵母粉、蔗糖、麥芽糖、阿拉伯糖、木糖等不同的碳、氮源試劑,浸泡1h滅菌,每個(gè)處理3次重復(fù),接種培養(yǎng)24h檢測。1.2.1真空培養(yǎng)養(yǎng)基、干燥箱、冷凍干燥器的制備用pH值7.5、蔗糖含量5%、酵母粉含量5%的水溶液配置麩皮豆粕培養(yǎng)基,基質(zhì)含水量65%,浸泡1h后滅菌,接種培養(yǎng)24h取出,置于滅菌濾紙上,分別放于65℃真空干燥箱、80℃恒溫烘箱和冷凍干燥器進(jìn)行干燥處理,每處理3次重復(fù)。以發(fā)酵結(jié)束時(shí)的活菌數(shù)為參照,干燥完畢檢測含菌量。2結(jié)果與分析2.1稀釋液中活菌數(shù)將含菌量與吸光度OD660值作線性回歸,得到方程y=1.827x+0.130,其中,x為吸光度值(0.1~0.8),y為稀釋液中活菌數(shù)(×108cfu/mL)。R2=0.990,表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線能準(zhǔn)確反映菌株發(fā)酵稀釋液中活菌數(shù)與光密度值的對應(yīng)關(guān)系。2.2固體發(fā)酵物含菌量Bs2004菌株在固體發(fā)酵物中的生長量與時(shí)間關(guān)系顯著(圖1)。該菌在4~16h內(nèi)生長量增加明顯,其OD660從0.024上升到0.337;16~32h,生長量變化趨于平緩,OD660值介于0.337~0.357,培養(yǎng)24h時(shí),含菌量達(dá)到最大,OD660值為0.357,即固體發(fā)酵物含菌量為7.8×109cfu/g。32h后,生長量急劇下降。由此可見,固體發(fā)酵Bs2004菌株,生長延遲期為0~4h,對數(shù)生長期為4~16h,16~32h為靜止生長期,32h后進(jìn)入生長衰亡期。2.3最佳發(fā)酵基質(zhì)的確定由表1可知,基質(zhì)種類對Bs2004菌株固體發(fā)酵生長量有顯著影響。其中單一麩皮、玉米粉及麩皮與米糠、玉米粉、豆粕組合和玉米粉與豆粕混合作為基質(zhì),菌株生長量顯著高于其他基質(zhì),麩皮與豆粕組合發(fā)酵,24h時(shí)含菌量最高,其OD值為0.363,即活菌數(shù)為7.9×109cfu/g,為最佳發(fā)酵基質(zhì)。單一谷殼、豆粕及其兩者組合作為基質(zhì)時(shí),其發(fā)酵物含活菌數(shù)極顯著低于其他基質(zhì),因此不宜用于Bs2004菌株的固體發(fā)酵。2.4培養(yǎng)基含水量對細(xì)菌總數(shù)的影響麩皮、豆粕培養(yǎng)基含水量對Bs2004菌生長的影響見表2。結(jié)果顯示含水量60%~70%的基質(zhì)中細(xì)菌總數(shù)達(dá)7.5×109cfu/g以上,極顯著高于其他含水量的培養(yǎng)基,而含水為50%、55%、75%的培養(yǎng)基間細(xì)菌總數(shù)無顯著異。說明培養(yǎng)基中水分含量過高和過低都不利于細(xì)菌生長。其原因應(yīng)與水分影響細(xì)菌對營養(yǎng)的吸收及培養(yǎng)基質(zhì)通氣性能有關(guān)。2.5菌生長力初始pH值顯著影響B(tài)s2004菌株的生長(圖2),當(dāng)pH值小于5.5時(shí),Bs2004菌生長力較弱,在pH值6.0~8.0條件下能較好地生長,OD660值介于0.638~0.733,當(dāng)pH值為7.0、7.5時(shí)生長最旺盛,發(fā)酵物稀釋液OD660分別為0.773、0.774。當(dāng)pH值大于8.0時(shí),Bs2004菌生長量隨pH值增加而急劇下降。2.6固體發(fā)酵溫度對bs2004菌生長的影響由圖3可知,該菌株在20~40℃均能生長。當(dāng)溫度為28~36℃時(shí),發(fā)酵物稀釋液OD660值大于0.31,即發(fā)酵產(chǎn)物含菌量超過6.9×109cfu/g,顯著高于其他溫度發(fā)酵物含菌量,其中當(dāng)溫度為32℃時(shí),Bs2004菌生長量最多,OD660值為0.361,說明32℃為該菌最適宜的固體發(fā)酵溫度。2.7bs2004菌的生長碳氮源差異對枯草芽孢桿菌Bs2004菌株固體發(fā)酵生長量的影響顯著(圖4)。蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、牛肉膏和酵母粉作為發(fā)酵氮源時(shí),硝酸鉀最不利于Bs2004菌的生長,發(fā)酵結(jié)束,稀釋液OD660值僅為0.012,以酵母粉作為氮源時(shí)OD660值為0.649,說明酵母粉為最適宜的Bs2004菌生長氮源。以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖等8種糖為碳源時(shí),乳糖、阿拉伯糖對應(yīng)的發(fā)酵物稀釋液OD660值顯著低于其他糖類,蔗糖作為碳源時(shí),OD660值為0.370,為最優(yōu)碳源。圖4顯示酵母粉為氮源,無碳源時(shí),活菌數(shù)達(dá)1.31×1010cfu/g,蔗糖為碳源,無氮源時(shí),活菌數(shù)為8.06×109cfu/g,由此看出,氮源對Bs2004菌株的生長具有顯著的促進(jìn)作用。2.8發(fā)酵物含菌量的變化經(jīng)發(fā)酵條件的篩選確定,各最優(yōu)因素組合發(fā)酵,得到發(fā)酵產(chǎn)物含菌量為9.62×109cfu/g。從表3可以看出,干燥方式顯著影響B(tài)s2004菌固體發(fā)酵產(chǎn)品中的含菌量。發(fā)酵物經(jīng)冷凍干燥和65℃真空干燥后,發(fā)酵物活菌數(shù)與干燥前差異不顯著,顯著高于80℃恒溫常壓干燥。真空干燥后含菌量為9.581×109cfu/g,優(yōu)于冷凍干燥,但兩者差異不顯著,說明Bs2004菌對低溫耐受力較強(qiáng),對高溫的耐受力較差,遇高溫細(xì)胞極易死亡,因此Bs2004菌株固體發(fā)酵物通過65℃真空干燥和冷凍干燥是可行的。3發(fā)酵條件及培養(yǎng)效果在生防枯草芽孢桿菌Bs2004菌株固體發(fā)酵過程中,發(fā)酵基質(zhì)種類、含水量、pH值、培養(yǎng)溫度、碳氮源種類以及干燥方式都直接影響發(fā)酵產(chǎn)物或發(fā)酵產(chǎn)品中活菌量。通過試驗(yàn)確定,麩皮或麩皮與豆粕等質(zhì)量的比例混合都是較好的發(fā)酵基質(zhì),發(fā)酵基質(zhì)含水量為65%,pH值7.5,以酵母粉為氮源,蔗糖為碳源,32℃培養(yǎng)24h為較優(yōu)發(fā)酵條件,發(fā)酵產(chǎn)物含菌量為9.62×109cfu/g。發(fā)酵物經(jīng)65℃真空干燥含菌量為9.581×109cfu/g,推薦為最佳干燥方式。