野生有鯽野生型封閉群遺傳多樣性研究

野生有鯽野生型封閉群遺傳多樣性研究

封閉組是指以非附近雜交模式繁殖和生產(chǎn)的實驗動物組。如果在不添加新個體的情況下，至少繁殖4代以上，也稱為封閉組。由于封閉群動物既保持一致的遺傳特性,個體之間又具有一定的雜合性,在遺傳上可作為選擇實驗的基礎群體,且封閉群動物避免了近交衰退,具有較高的生存和繁殖能力,可大量應用于實驗。目前,封閉群動物被廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等領域的研究與檢測中。稀有鯽(Gobiocyprisrarus)是我國特有的一種鯉科魚類,經(jīng)過近20年的實驗動物化研究與應用,已逐漸成為我國重要的魚類實驗動物,在環(huán)境科學、遺傳學等領域具有極高的應用價值。同時,稀有鯽也是《中國瀕危動物紅皮書:魚類》收錄的瀕危魚類,因人類活動的影響,其野生種群正面臨著威脅。因此,建立稀有鯽野生型封閉群,不僅有助于為生態(tài)毒理學研究與化學品測試等領域的應用批量提供實驗魚,而且該封閉群也可以作為新品系篩選與培育的種源,甚至可用于野生種群的恢復與重建。由于封閉群動物數(shù)量通常較大、又采用遠交的方式繁育,因此一直未確立公認的遺傳質量檢測方法和控制標準。我國現(xiàn)行的實驗動物國家標準僅對哺乳類實驗動物封閉群的定義、繁殖方法等進行了規(guī)范,但未提出封閉群遺傳質量監(jiān)測方法;而對魚類實驗動物更是沒有統(tǒng)一的方法和標準。近些年來,微衛(wèi)星標記被廣泛地用于常見實驗動物和模型動物的遺傳質量監(jiān)測,并有可能逐漸取代生化標記成為最常用的實驗動物遺傳質量檢測手段。許多研究者通過篩選特異性、多態(tài)性和靈敏性高的位點在品系純度檢測、品系鑒定等方面取得了良好的結果,證明了微衛(wèi)星標記在實驗動物遺傳質量監(jiān)測中的可行性和優(yōu)越性,為建立不同品系基于微衛(wèi)星標記的實驗動物遺傳質量監(jiān)測方法奠定了基礎[9—23]。本文報道了利用微衛(wèi)星標記對稀有鯽野生型封閉群培育過程中各代遺傳質量進行檢測的結果,以期為該封閉群的保種、引種以及應用提供背景資料,為建立魚類實驗動物封閉群遺傳質量監(jiān)測標準提供參考。1材料和方法1.1藥物代謝fps的培育2006年從稀有鯽模式產(chǎn)地——四川省漢源縣九襄采集野生個體帶回實驗室馴養(yǎng)。2007年挑選健康個體隨機配對50對作為培育封閉群的原代(P0),并由此得到每對魚的F1。從每對魚的F1中取1雌1雄,按照最佳避免近交法進行配對繁殖,得到F2。然后連續(xù)按照最佳避免近交法的方式培育得到F3、F4和F5。參照國家標準《實驗動物-哺乳類實驗動物的遺傳質量控制》中封閉群實驗動物的定義和命名原則,作者將該封閉群命名為Ihb:IHB,表示由中國科學院水生生物研究所培育的稀有鯽封閉群。1.2實驗材料用于遺傳監(jiān)測的樣本為P0、F1—F4代傳代親本,每代50對,共計500尾。樣本進行生物學測量后用95%酒精固定,置冰箱中保存。1.3提取和檢測各組dna取樣本背部肌肉,采用Aljanabi&Martinez提出的鹽析法提取基因組DNA,利用瓊脂糖電泳技術檢測DNA的質量和濃度。1.4引物的合成本研究使用了11對微衛(wèi)星引物,分別是Gra02、Gra03、Gra04、Gra16、Gra20、Gra21、Gra30以及GR08、GR09、GR29、GR38,所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。1.5taq酶及dna模板PCR反應總體積為10μL,其中10×PCRbuffer1μL,dNTP(2.5mmol/L)0.8μL,上游引物(5pmol/μL)1μL,下游引物(5pmol/μL)1μL,Taq酶(2U/μL)0.5μL,DNA模板(0.02mg/μL)1μL,滅菌雙蒸水3.7μL。PCR反應條件:94℃預變性5min,94℃變性30s,退火40s(退火溫度見表1),72℃延伸40s,35個循環(huán)后,72℃充分延伸10min。反應產(chǎn)物經(jīng)10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(丙烯酰胺:N-N,亞甲雙丙烯酰胺,29:1),電泳產(chǎn)物采用EB染色,然后利用GeneGenius凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照。根據(jù)DNA在聚丙烯酰胺膠上的泳動距離進行結果判讀,等位基因大小通過與pBR322DNA/MspI分子量標準進行比對后獲得。1.6遺傳多樣性評估利用POP-GENE32、Arlequin3.11、FSTAT、PIC-CALC和SPSS16.0等軟件檢驗哈迪溫伯格平衡;計算各位點的觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He),評估位點及群體的遺傳多樣性;計算遺傳分化指數(shù)(FST)、Nei遺傳距離(Geneticdistance)和相似性系數(shù)(Geneticsimilarityindices)以評估封閉群各個世代的遺傳關系;利用Bonferroni校正程序來調整多重比較的顯著水平。此外,利用Fisher’sexact方法對等位基因頻率(Allelefrequencies)進行檢驗,檢測各世代等位基因頻率的變化。2結果2.1基因數(shù)范圍、多態(tài)信息含量11個位點在稀有鯽封閉群共發(fā)現(xiàn)等位基因57個,每個位點等位基因數(shù)(Na)為2—12個,平均5.2個;有效等位基因數(shù)范圍(Ne)1.4—8.6,平均為3.3個;多態(tài)信息含量(PIC)0.2257—0.8730,平均為0.5282。11個位點中有4個位點(Gra02、Gra16、Gra20、GR09)偏離哈迪溫伯格平衡。另外,11個位點中除Gra21外,其他位點均表現(xiàn)為雜合子缺失(表1)。2.2各代指數(shù)的基因特征分別統(tǒng)計了稀有鯽封閉群各代在所有位點的平均觀察等位基因數(shù)(Na)、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均觀察雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)、平均多態(tài)信息含量(PIC),發(fā)現(xiàn)各組指數(shù)在各代之間差異均較小,且未達到顯著水平(表2)。2.3封閉群各粒徑間的遺傳變異稀有鯽封閉群的FST結果顯示:稀有鯽封閉群不同世代在遺傳結構上無顯著差異(P>0.05),11個位點FST為0.0008(表1),表明各世代間的遺傳變異占總遺傳變異的0.08%(P=0.5992)。對封閉群各世代進行兩兩比較發(fā)現(xiàn),任意兩世代間的FST值從0.0001—0.0031,且遺傳結構在各世代間均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。依據(jù)11個微衛(wèi)星位點PCR擴增結果,計算出群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離(Nei1972)(表4),各代之間的遺傳相似性系數(shù)均在0.99以上,表明各代間遺傳差異較小,具有很高的遺傳相似度。2.4各代基因頻率利用Fisher’sexact精確檢驗對各代基因頻率進行檢驗,發(fā)現(xiàn)各位點的等位基因在各代間均無顯著性差異(P>0.05)(表5),各代基因頻率(表5)。3討論3.1群體遺傳多樣性根據(jù)Botstein,etal.提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標:當PIC>0.5時,該位點為高度多態(tài)性位點;當0.25<PIC<0.5時,該位點為中度多態(tài)性位點;當PIC<0.25時,該位點為低度多態(tài)性位點。在本研究中所檢測的11個多態(tài)性位點6個為高度多態(tài)性位點,4個位中度多態(tài)性位點,1個為低度多態(tài)性位點,PIC平均值為0.5282,具有較高的遺傳多樣性,11個位點的平均觀察等位基因數(shù)為5.2,平均有效等位基因數(shù)為3.3,均可較好地反應稀有鯽封閉群的遺傳學特性。在本研究中發(fā)現(xiàn)多個微衛(wèi)星位點存在雜合子缺少現(xiàn)象,而且較高的Fis值也意味著雜合子缺失現(xiàn)象的存在,并出現(xiàn)少數(shù)位點偏離哈迪溫伯格平衡的情況,與Liao,etal.、He,etal.分別報道的野生種群的情況相似,這與稀有鯽的生境和集群生活有關,由于稀有鯽群聚于稻田、溝渠、水洼等小水體中,在這樣的生境中,某一群體的稀有鯽個體可能來自于少數(shù)親本的子代,導致了群體近交的發(fā)生,從而導致了雜合子的缺失。本文選取了常用的11對稀有鯽微衛(wèi)星引物,不僅具有較高遺傳多樣性,且便于與其他研究結果比較。通過這些微衛(wèi)星位點的遺傳分析,Ihb:IHB封閉群具有較高的遺傳多樣性,各世代(P0-F4)的平均期望雜合度為0.5553—0.5742;各代的平均多態(tài)信息含量范圍為0.5060—0.5318,各代之間均無顯著性差異(P>0.05),均保持了野生個體(P0)的遺傳多樣性。關于采自漢源縣稀有鯽模式產(chǎn)地樣本的遺傳多樣性,已有一些文獻報道。Liao,etal.、He,eal.分別報道1997年野生種群的期望雜合度為0.6459和0.62,邵燕等、He,etal.分別報道2006年野生種群期望雜合度為0.5744和0.56。本研究中的原代親魚于2006年秋季采集,與He,etal.的標本同批采集,封閉群原代以及F1-F4代的期望雜合度與文獻報道的十分相近,由此表明Ihb:IHB保持了野生種群的遺傳多樣性。本研究還表明,稀有鯽封閉群P0-F4代FST值為0.0008(P=0.5992),依據(jù)遺傳分化FST的解釋,稀有鯽封閉群各代之間的遺傳分化程度極弱,遺傳變異主要發(fā)生在各代內部個體之間。對封閉群中不同世代FST的兩兩比也發(fā)現(xiàn)各世代間無顯著遺傳分化(P>0.05)。同時,稀有鯽封閉群各代間的遺傳相似性指數(shù)都在0.99以上,根據(jù)Thorp對遺傳相似性系數(shù)的解釋,說明稀有鯽封閉群保存了野生種群的遺傳學特征,且各代間遺傳特性較穩(wěn)定。封閉群動物既保持群體的一般遺傳特性,又要求個體之間具有一定的雜合性,是介于近交系和群體遺傳動物之間的特殊群體。其遺傳學特點主要體現(xiàn)在:個體間具有較大的遺傳變異,群體的遺傳特性保持穩(wěn)定。目前,對于封閉群動物的遺傳性狀控制主要針對以下幾個方面:(1)所有基因的頻率保持相對穩(wěn)定;(2)在群體內保持其個體間較大的遺傳性狀差異;(3)群體內未出現(xiàn)遺傳分化,遺傳多樣性指標變化維持在一定的范圍內。本研究表明,稀有鯽封閉群Ihb:IHB具有較高的遺傳多樣性,同時各代的基因頻率保持穩(wěn)定,無顯著的遺傳分化,保持了野生種群的遺傳多樣性。因此,從遺傳質量監(jiān)測的結果來看,Ihb:IHB的培育較為成功,符合實驗動物封閉群的要求,可以作為一個實驗動物品系;同時該群保持著與野生種群相似遺傳結構,也預示著它可能在物種保護的行動中得到應用。3.2封閉群遺傳檢測封閉群動物由于遺傳組成的雜合性,容易受到選擇、近交和隨機遺傳漂變等影響而發(fā)生遺傳上的改變,在較長時間繁殖和分離繁殖后,其遺傳組成肯定有一定程度的改變,且封閉群動物缺乏系統(tǒng)的遺傳控制標準,因此封閉群動物經(jīng)常被錯誤地用于各種實驗中。Chai,etal.對大鼠封閉群的研究發(fā)現(xiàn),由于封閉群的遺傳特點,即使是來源相同,命名相同的同一封閉群,在不同時期,遺傳結構很可能也有差異,這種情況經(jīng)常造成對藥物或某種實驗處理的反應出現(xiàn)差異,如果動物來自不同的飼養(yǎng)機構,具有相同名稱的封閉群動物更是如此。因此封閉群的質量控制是保證實驗結果可靠的前提。大部分常用的實驗動物封閉群都利用微衛(wèi)星標記進行了遺傳檢測,并取得了較好的效果,建立了各品系實驗動物遺傳檢測的方法和標準。例如斑馬魚封閉群、Wistar大鼠、封閉群小鼠、SD大鼠封閉群、金黃地鼠封閉群、昆明小鼠封閉群、比格犬封閉群都應用了微衛(wèi)星技術對遺傳多樣性進行了監(jiān)測,設計并挑選了相應的引物,闡述了微衛(wèi)星技術在封閉群監(jiān)測的適用性,并分析了雜合度、多態(tài)信息含量等群體遺傳指標,為進一步的檢測提供了依據(jù)。但是,封閉群的遺傳控制與群體遺傳有一定的相似性,但又不完全相同,且大部分封閉群都缺乏長期的遺傳監(jiān)測和封閉群基因頻率的變化,不能有效地對其遺傳背景變化做出反饋,無法保證群體相對穩(wěn)定的遺傳特征,從而導致了封閉群的遺傳分化,并經(jīng)常出現(xiàn)偏離哈迪溫伯格平衡的現(xiàn)象。在本研究中,