牡丹葉對不同受體植物幼苗生長的影響

牡丹葉對不同受體植物幼苗生長的影響

牡丹是牡丹科的一種落葉灌木。它是重要的觀賞植物和藥物。其根皮為常用中藥材,內(nèi)含的丹皮酚具有抗血栓形成、抗動脈硬化、降血壓、保護腦組織等多種藥理作用?；ò旮缓喾印㈩慄S酮與花色苷,具抗氧化活性和自由基清除能力。牡丹籽提取物Ⅱ(脂溶性成分)對枯草桿菌、沙門氏菌、根霉菌和黑曲霉菌均有一定的抑制作用。提取物Ⅲ(水溶性成分)對枯草桿菌、沙門氏菌和巴氏桿菌均有一定抑菌作用。葉中所含有的黃酮類化合物對大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和沙門氏菌(Salmonella)3種細菌均有較強的抑制作用。黃酮類化合物還具有抗氧化、清除自由基、消炎、調(diào)節(jié)血脂、抗癌、抗HIV等廣泛的生物活性。羅小勇采用瓊脂混粉法測定了牡丹不同器官粉末對生菜、黃瓜、反枝莧、苘麻、小麥和稗6種受體植物幼苗生長的影響,發(fā)現(xiàn)除莖器官外,其他各器官的粉末在10g/L的添加濃度下,對各受體植物幼苗的生長均具有明顯的抑制作用,且對胚根或種子根的抑制效果明顯高于對胚軸或胚芽鞘的抑制。各器官中以根和葉的效果最好,花、果實和葉柄次之,莖最低。除此之外,尚未見其他有關牡丹對植物幼苗具有抑制效應的報道。本研究選擇活性最高的葉器官進一步測定了其粉末在不同濃度下對生菜、小麥、稗、黃瓜、夏至草、播娘蒿和獨行菜等7種受體植物幼苗生長的影響,并探索了其不同溶劑提取物的抑制活性大小,以期為進一步開展植物源活性物質(zhì)的提取分離及開發(fā)提供依據(jù)。1材料和方法1.1電動粉碎機制備牡丹葉于2011年5月采自青島農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)。將其置陰涼處干燥后,用電動萬能粉碎機(FW100型,轉(zhuǎn)速24000r/min,天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn))粉碎1～2min,取過40目鐵篩的粉末于低溫冰箱(1℃)中保存?zhèn)溆谩?.2cumeastivuml.生菜(Lactucasativavar.ramosaHort,抗熱綠湖黑核西生菜特選種388,蔡興利國際有限公司生產(chǎn),美國)、小麥(TriticumaestivumL.,煙農(nóng)24號)、黃瓜(CucumissativusL.,青研85F12)、稗[Echinochloaarusgalli(L.)Beauv.]、夏至草[Lagopsissupine(Steph.)IK.-Gal.exKnorr.]、播娘蒿[DescurainiaSophia(L.)Schur.]和獨行菜(LepidiumapetalumWilld.)。雜草種子均采自青島農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)。1.3測試方法1.3.1水提取液的制備稱取30g牡丹葉粉末3份置于3個500mL三角瓶中,分別加入99.5%甲醇溶液、99.7%乙醇溶液和蒸餾水各300mL,充分搖勻使之全部潤濕后置室溫(20℃)下浸提,每隔3h攪拌1次,2d后過濾,收集濾液。而后按同樣方法再提取2次。合并3次濾液,真空抽濾(Whatman,No2.)后于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),得到浸膏。水提取液置于45℃水浴鍋內(nèi)自然風干。針對乙醇溶劑還進行了0、20%、40%、60%、80%和100%不同溶劑濃度的提取試驗。1.3.2牡丹花葉提取物的處理采用羅小勇提出的瓊脂混粉法進行。將受體植物種子經(jīng)0.2%次氯酸鈉溶液浸泡15min后,用自來水沖洗數(shù)次并置流水下浸泡吸水3～5h(根據(jù)室內(nèi)溫度調(diào)整時間),而后用蒸餾水洗滌數(shù)次,均勻擺放于帶蓋方盤內(nèi)的吸水紙上,滴加蒸餾水至種子不漂浮,遮光置于全智能人工氣候箱(HP1000GS-B型,武漢瑞華儀器設備有限責任公司生產(chǎn))內(nèi)發(fā)芽,24～72h后胚根或幼根的長度將達到3～5mm。稱取0.5g瓊脂粉末分別置于250mL三角瓶內(nèi)后加入94.5～99.5mL蒸餾水(根據(jù)所加樣品的濃度調(diào)整水量),放入微波爐內(nèi)加熱至完全溶解后靜置,待冷卻至60℃時分別加入事先稱好的牡丹葉粉末或不同溶劑提取物,然后分別均勻倒入3個小塑料杯內(nèi),冷凝,配制成含有不同濃度供試材料的0.5%瓊脂凝膠,以未加供試材料的0.5%瓊脂凝膠為對照處理。其中,葉粉末的供試濃度梯度分別為0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0g/L,牡丹葉提取物的供試濃度梯度分別為0、0.05、0.25、0.5、2.5、5.0g/L。移植時先用尖嘴鑷子在已凝固的瓊脂表面插5個小孔,而后分別夾取胚根長度基本一致的已發(fā)芽指示植物種子,將胚根垂直由小口輕輕植入瓊脂凝膠中。每杯5粒,重復3次。而后將所有杯子用錫紙封口并置于已消毒的小紙箱內(nèi),為防止光照對化合物及植物幼根生長的影響,將小紙箱放入人工氣候箱遮光培養(yǎng)3～4d。人工氣候箱的設置條件為:14h(25℃)光照和10h(20℃)黑暗的自動循環(huán),箱內(nèi)的相對濕度為60%。待處理結束后用電子游標卡尺分別測量受體植物幼苗胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)的長度。按下式計算胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)的實際生長量,應用EXCEL軟件,以生長量為基數(shù),分別計算不同濃度的牡丹葉粉末處理之后對指示植物胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)生長的抑制率以及樣本的誤差。同時應用SPSS軟件計算出有效中濃度(EC50),并以LSD法對獲得的抑制率進行差異顯著性分析。生長量=處理后的胚根(胚軸)長-處理前的胚根(胚軸)長抑制率(%)=(對照生長量-處理生長量)/對照生長量×1002結果與分析2.1不同濃度的牡丹葉粉末對七種受體植物幼苗的生長有影響2.1.1不同供試濃度對夏至草幼苗胚根和胚軸生長的影響表1所示為不同濃度牡丹葉粉末對雙子葉植物幼苗生長的影響?？梢?牡丹葉粉末對所有受體植物胚根和胚軸生長的抑制率隨著供試濃度的增加而增大,且對胚根生長的抑制作用明顯高于對胚軸的抑制。其中,對生菜而言,在0.625g/L的最低供試濃度下,幼苗胚根的生長就已經(jīng)受到一定的抑制,抑制率為29.3%,而對胚軸的生長幾乎沒有影響。此后,隨著供試濃度的增加,對胚根/胚軸生長的抑制率依次提高,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下對二者的抑制率分別達到69.3%/21.6%、81.6%/31.3%、92.5%/45.7%和96.7%/67.4%,其中,除了兩個高濃度對胚根的抑制及兩個低濃度對胚軸的抑制差異不顯著外,其余均達顯著水平。計算對二者的EC50分別為0.93、5.25g/L。但對黃瓜幼苗胚根和胚軸生長的影響,0.625g/L的最低供試濃度下影響均不明顯,抑制率分別僅為6.3%和4.8%。此后,隨著供試濃度的增加,對胚根和胚軸生長的抑制率依次提高,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下對二者的抑制率分別達到26.4%和12.9%、33.7%和16.3%、61.9%和23.1%、79.0%和29.0%,其中,對胚根的抑制除了兩個低濃度之間差異不顯著外,其余均達顯著水平,對胚軸的抑制除3個高濃度之間、2個低濃度之間及1.25g/L和2.5g/L兩濃度之間均不顯著外,其余均達顯著水平。計算對二者的EC50分別為3.58g/L和>10.0g/L。夏至草幼苗胚根和胚軸的生長在0.625g/L的最低供試濃度下均受到一定的抑制,抑制率分別為17.7%和14.4%。在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下則分別提高到66.4%和20.3%、85.8%和27.7%、95.1%和47.4%、97.4%和68.3%,其中,除了兩個高濃度對胚根的抑制差異不顯著,以及0.625、1.25g/L兩濃度之間對胚軸的抑制差異不顯著外,其余均達顯著水平。計算對二者的EC50分別為1.09、5.27g/L。播娘蒿在0.625g/L的最低供試濃度下,其幼苗胚根和胚軸的生長不但沒有受到抑制,反而顯示出一定的促進作用。但在1.25g/L的供試濃度下,胚根的生長受到顯著的抑制,抑制率達67.9%,對胚軸生長的影響則較輕微。此后,隨著供試濃度的增加,對胚根和胚軸生長的抑制率依次提高,在2.5、5.0、10.0g/L濃度下對二者的抑制率分別達到87.3%和8.4%、96.3%和25.3%、97.1%和51.0%,其中,除了兩個高濃度及兩個低濃度對胚根的抑制差異不顯著,以及1.25g/L濃度處理與空白對照對胚軸的抑制差異不顯著外,其余均達顯著水平。計算對二者的EC50分別為1.02g/L和9.65g/L。獨行菜在0.625g/L的最低供試濃度下,只有胚根的生長受到明顯的抑制,抑制率為31.4%,而胚軸的生長則受到輕微的促進。此后,隨著供試濃度的增加,對胚根和胚軸生長的抑制率依次提高,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下對二者的抑制率分別達到77.2%和9.9%、94.2%和31.9%、96.8%和45.5%、98.7%和55.2%,其中,3個高濃度下對胚根的抑制差異不顯著,對胚軸的抑制差異在2個高濃度和3個低濃度下均不顯著,其余均達顯著水平。計算對二者的EC50分別為0.79g/L和6.84g/L。2.1.2供試濃度對胚芽劍生以小麥和稗為單子葉受體植物測定了牡丹葉粉末在不同濃度下對幼苗生長的影響,其結果見表2?？梢?與上述雙子葉受體植物一樣,它們的幼苗生長也受到了顯著的抑制,抑制作用隨供試濃度的增加也明顯提高,且對種子根的抑制作用明顯高于對胚芽鞘的抑制。小麥在0.625g/L的最低供試濃度下,只有種子根的生長受到明顯抑制,抑制率為28.0%。此后,隨著供試濃度的增加,對胚芽鞘的生長也顯示出明顯的抑制,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下對種子根和胚芽鞘的抑制率分別達到55.3%和29.1%、74.1%和42.7%、81.2%和52.3%、87.4%和60.8%,除兩個低濃度對胚芽鞘的抑制差異不顯著外,其余均達顯著水平。計算對二者的EC50分別為1.20g/L和4.65g/L。稗幼苗種子根和胚芽鞘的生長在0.625g/L的最低供試濃度下均受到顯著的抑制,抑制率分別為39.0%和20.6%。此后,隨著供試濃度的增加,對二者生長的抑制率依次提高,在1.25g/L、2.5g/L、5.0g/L和10.0g/L濃度下抑制率分別達80.6%和39.4%、88.3%和50.3%、91.2%和56.4%、96.5%和62.6%,除2.5g/L和5.0g/L兩濃度之間對種子根的抑制差異不顯著外,其余均達顯著水平。計算對二者的EC50分別為0.64g/L和3.36g/L。2.2種溶劑提取物對生姜幼苗胚根和胚軸的抑制效果表3所示為牡丹葉不同溶劑提取物對生菜幼苗生長的影響?？梢?盡管在低濃度下,各溶劑提取物對生菜幼苗生長的影響有所差異,但在高濃度下,均顯示出較高的抑制作用,尤其是乙醇和甲醇提取物。在2.5g/L和5.0g/L濃度下,3種溶劑提取物對生菜幼苗胚根和胚軸的抑制率,乙醇為94.2%和54.4%、97.2%和69.3%,甲醇為94.5%和49.1%、97.0%和61.3%,蒸餾水為77.2%和11.3%、89.5%和29.3%。計算EC50分別為0.25g/L和1.56g/L、0.44g/L和2.74g/L、0.82g/L和>5.0g/L。2.3牡丹花葉片提取物對種子生長和胚軸抑制率的影響根據(jù)上述結果,選擇提取物活性最高的乙醇作為提取溶劑進行了不同提取濃度試驗,其結果見圖1?？梢?用20%、40%、60%、80%和100%乙醇溶液處理牡丹葉片粉末所得到的提取物對生菜幼苗胚根生長的抑制率均較高,依次為92.5%、97.6%、98.0%、99.1%和97.7%,而對胚軸的抑制率相對較低,依次分別為31.2%、47.3%、53.7%、63.5%和69.7%。3不同受體植物幼苗生長的差異許多研究表明,植物在生長過程中會產(chǎn)生許多具有植物化感活性的物質(zhì),當這些物質(zhì)通過淋溶、揮發(fā)、根系分泌或殘株分解進入周圍環(huán)境后,會對其他植物或自身的生長產(chǎn)生影響。但不同植物間、同一植物的不同器官間化感作用的大小有著較大的差異。牡丹也不例外,各器官在10g/L的處理濃度下,對生菜、小麥等多種受體植物幼苗的生長都表現(xiàn)出較高的抑制活性,即化感活性,且以根和葉的效果最好,這是國內(nèi)外牡丹對植物幼苗生長具有抑制活性的首次報道。本研究在此基礎上進一步測定了其葉器官粉末在不同濃度下對生菜、小麥、黃瓜、稗草、夏至草、播娘蒿和獨行菜等7種受體植物幼苗生長的影響,發(fā)現(xiàn)不同受體植物的敏感性存在較大差異,呈現(xiàn)出一定的選擇性。其中,以稗的敏感性最強,抑制其種子根和胚芽鞘生長所需的有效中濃度(EC50)分別只有0.64g/L和3.36g/L,而黃瓜的敏感性最低,抑制其幼苗胚根和胚軸生長所需的EC50分別為3.58g/L和>10.0g/L,其他植物的敏感性則介于稗與黃瓜之間。稗、播娘蒿、獨行菜、夏至草都是常見的農(nóng)田雜草,其中,稗和播娘蒿更是危害小麥等多種作物的惡性雜草,牡丹葉對幾種雜草所表現(xiàn)出的高抑制活性說明該器官中可能含有可供除草劑開發(fā)的活性物質(zhì)。為了進一步提取分離這些高活性物質(zhì),本研究以提取物對植物幼苗生長的抑制活性大小為指標,探索了不同溶劑提取物的抑制效果,發(fā)現(xiàn)乙醇和甲醇提取物對生菜幼苗生長的抑制活性高于蒸餾水提取物的抑制效果,而兩種有機溶劑之間以乙醇的抑制效果較高。因而,選擇乙醇為提取溶劑,進一步測定了其最佳提取濃度,發(fā)現(xiàn)在10.0g/L的供試濃度下,以80%乙醇溶液提取物對生菜幼苗生長的抑制活性最高。這些結果為牡丹葉中活性物質(zhì)的進一步提取分離提供了重