關(guān)于濫用表中有效應(yīng)對(duì)的藥物提取的研究

關(guān)于濫用表中有效應(yīng)對(duì)的藥物提取的研究

世界博覽會(huì)規(guī)定，使用酒精違反體育和科學(xué)道德。按照國際奧委會(huì)醫(yī)學(xué)委員會(huì)的定義,使用興奮劑包括:使用屬于禁用藥物類的有關(guān)物質(zhì)及使用各種不同的禁用方法。利尿劑屬于興奮劑中的一種,自從1989年冬奧運(yùn)會(huì)宣布禁用利尿劑以來,利尿劑一直是監(jiān)控的重點(diǎn)。這不僅由于利尿劑在涉及重量級(jí)別項(xiàng)目(如舉重、拳擊等)中可用于減輕運(yùn)動(dòng)員體重,而且還常被作為一種稀釋尿液掩蓋其他禁用藥物的手段。因此除比賽期間外,在賽外抽查時(shí)也必須檢查利尿劑。由于社會(huì)上總有一些違背體育道德的人不斷發(fā)掘藥物用于體育比賽中,因此在國際奧委會(huì)公布的禁用表中,每年都會(huì)有一些新的藥物出現(xiàn)。近年來,禁用表中也有不少新的利尿劑出現(xiàn),如吲滿速尿、克羅帕米、利多速尿和托拉沙米等。另外,按照國際奧委會(huì)對(duì)興奮劑的定義,未列入表內(nèi)的相關(guān)化合物也同屬于禁用范疇。為及時(shí)跟上國際步伐,盡早建立和完善利尿劑的檢測(cè)方法,我們對(duì)新增藥物及系列利尿劑的相關(guān)化合物進(jìn)行了研究。有關(guān)這些藥物的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)方法有部分報(bào)道,但缺乏系統(tǒng)分析的資料。作者首次用HPLC方法同時(shí)檢測(cè)了人尿中13種利尿劑,建立了HPLC的篩選方法。1實(shí)驗(yàn)部分1.1de,tor吲滿速尿(indapamide,IND)的對(duì)照品來自Sigma;克羅帕米(clopamide,CLOP)、利多速尿(xipamide,XIP)、托拉沙米(torasemide,TOR)由韓國興奮劑實(shí)驗(yàn)室提供;吡咯它尼(piretanide,PIR)、聚噻嗪(polythiazide,POLY)、氟甲噻嗪(flumethiazide,FLU)、三氯噻嗪(trichlomethiazide,TRI)、甲氯噻嗪(methylclothiazide,METH)、氫氟噻嗪(hydroflumethiazide,HF)、環(huán)噻嗪(cyclothiazide,CYC)、依托唑啉(etozoline,ETO)和喹噻酮(quiethazone,QUI)由加拿大INRS-Sante實(shí)驗(yàn)室提供。1.2流動(dòng)相、淋洗梯度HP1090高效液相色譜儀(美國),LichrosorbC18200mm×4.6mm,5μm液相色譜柱;流動(dòng)相:pH3磷酸緩沖液(A)和乙腈(B);淋洗梯度:0.01minB15%(φ),10minB45%(φ),20minB65%(φ);DAD檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng):216nm,230nm,275nm。1.3樣品處理1.3.1有機(jī)相的制備取尿樣3mL,加入酸性固體緩沖劑(磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉,質(zhì)量比99∶1,pH5.0)0.5g,搖勻后加入4mL乙酸乙酯,振蕩萃取15min,離心分離出有機(jī)相,加入2mL50g/L醋酸鉛溶液,振蕩離心,吹干有機(jī)相,加入300μL甲醇溶解殘?jiān)M(jìn)樣。1.3.2u3000酸鉀溶液的萃取取尿樣3mL,加入堿性固體緩沖劑(碳酸氫鈉-碳酸鉀,質(zhì)量比3∶2,pH9.0)0.5g,搖勻后加入4mL乙酸乙酯,振蕩萃取15min,離心分離出有機(jī)相,吹干,加入300μL甲醇溶解殘?jiān)M(jìn)樣。1.3.3固相萃取取尿液3mL過預(yù)先處理好的Sep＿Pak柱,水洗后,用甲醇洗脫,吹干,加入300μL甲醇溶解殘?jiān)M(jìn)樣。1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備于10mL具塞試管中加入2mL空白尿液,分別加入1μg上述藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述提取方法分別對(duì)藥物進(jìn)行萃取。萃取物分別于50℃干熱反應(yīng)器上氮?dú)饬鞔蹈?各加入300μL甲醇,進(jìn)樣10μL進(jìn)行色譜分離,然后與相同量對(duì)照品對(duì)照,測(cè)定峰面積,依次計(jì)算出各種化合物萃取的回收率。2結(jié)果與討論2.11可疑化合物的初步篩選按上述HPLC條件,除吲滿速尿與托拉沙米有部分重疊外,其他11種利尿劑均得到了很好的分離。如圖1和圖2所示,根據(jù)色譜中的保留時(shí)間及其特征的紫外光譜,可初步篩選出可疑化合物的存在。雖然吲滿速尿與托拉沙米的保留時(shí)間比較接近,但是兩者的紫外光譜有明顯的差異,最大吸收值差別很大,很容易區(qū)分。2.2萃取回收率和萃取選擇性測(cè)定興奮劑時(shí)對(duì)尿樣的處理大多采用液相萃取。根據(jù)其性質(zhì)采取酸性、堿性或中性萃取。我們分別用酸性萃取、堿性萃取和固相萃取(SPE)3種方法提取了上述藥物,結(jié)果見表1。堿性萃取回收率除吡咯它尼為23%以外,其他12種化合物均比較高(>80%);固相萃取率除依托唑啉偏低為16%,三氯噻嗪為59.2%外,其它基本在75%以上。但是固相萃取選擇性較差,雜質(zhì)峰比較多。分別取不同量上述對(duì)照品溶液加入空白尿中,按上述方法堿性萃取后進(jìn)樣分析,觀察各進(jìn)樣量下獲得的色譜圖,找出其最小進(jìn)樣量,以3倍信噪比測(cè)定檢出限(DL),按絕對(duì)進(jìn)樣量計(jì)算,該13種利尿劑的檢出限列于表1內(nèi),基本小于5ng,完全可以滿足國際奧委會(huì)的要求。2.3利尿劑的應(yīng)用陽性尿由健康志愿者服藥后提供分別對(duì)吲滿速尿、克羅帕米、利多速尿、托拉沙米、吡咯它尼和聚噻嗪6種藥物4～20h的陽性尿進(jìn)行了檢測(cè),均獲得滿意的結(jié)果。圖3為服用1mg的利多速尿后6h收取的尿樣的HPLC色譜及紫外光譜圖。由于利尿劑在服藥后,主要以原型的形式從尿樣中排出,對(duì)于無法獲得陽性尿的藥物,我們將一定量對(duì)照品加入尿中進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果同樣令人滿意。在常規(guī)檢測(cè)中,對(duì)于可疑樣品,可以通過與陽性尿圖譜的保留時(shí)間及其特征的紫外圖譜對(duì)照,進(jìn)行初步定性。如果需要,再通過質(zhì)譜進(jìn)一步確證。2.4原型化合物的檢測(cè)分別對(duì)吲滿速尿、克羅帕米、利多速尿、托拉沙米、吡咯它尼和聚噻嗪6種藥物的排泄曲線進(jìn)行了研究,見圖4。幾