黑曲霉發(fā)酵-葡萄糖苷酶補料工藝研究

黑曲霉發(fā)酵-葡萄糖苷酶補料工藝研究

-葡萄糖苷酶是纖維素酶的重要酶成分之一。在木霉纖維素酶水解天然纖維素的過程中,添加外源β-葡萄糖苷酶是降低水解液中纖維素二糖積累量、提高酶解得率的有效方法之一。此外,β-葡萄糖苷酶可作為風味酶應用于(果)酒、茶葉、果汁中起到增香作用;可應用于乳品工業(yè)中分解乳糖;也可應用于催化葡萄糖發(fā)生轉(zhuǎn)移反應和縮合反應合成功能性低聚糖等。因此,高活力、低成本的β-葡萄糖苷酶制備技術(shù)已成為國內(nèi)外在這些領(lǐng)域中的研究熱點。分批補料發(fā)酵是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù),指在微生物分批發(fā)酵中,以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)補加一定物料的培養(yǎng)技術(shù)。通過向培養(yǎng)系統(tǒng)中補充物料,可以使培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物濃度較長時間地保持在一定范圍內(nèi),既保證微生物的生長需要,又不造成不利影響,從而達到提高產(chǎn)率的目的。β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)和其他酶制劑一樣,高濃度的液體深層發(fā)酵會對菌體的生長和代謝物的分泌產(chǎn)生抑制作用。所以,一次性添加大量營養(yǎng)物質(zhì)不利于產(chǎn)酶,而將營養(yǎng)分批加入可以解除營養(yǎng)基質(zhì)本身帶來的抑制作用及其代謝積累產(chǎn)物的反饋抑制作用以及葡萄糖分解阻遏效應。另一方面,β-葡萄糖苷酶是一種誘導酶,但誘導物的濃度及誘導時間影響著誘導能力。作者以麩皮和纖維二糖為補加物料,研究了補料量、補料次數(shù)、發(fā)酵基料中麩皮的初始濃度及補料方式對黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶的影響,以期達到大幅度提高β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的目的。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗中的細菌A.nigernl-1由南京林業(yè)大學微生物實驗室保藏。4℃保存在PDA平板培養(yǎng)基中。1.1.2馬鈴薯、蔗糖、脂馬鈴薯斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。其中,馬鈴薯20%,蔗糖2%,瓊脂2%。液體發(fā)酵基本培養(yǎng)基采用改進的Vogel培養(yǎng)基,即碳源使用4%的麩皮。1.2準備和檢測方法1.2.1制備芽孢桿菌菌懸液將菌種在無菌條件下接入PDA平板培養(yǎng)基中,置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7d。菌株待孢子長滿斜面后用無菌水制成孢子菌懸液。其中,孢子含量為4×106個/mL。1.2.2初始ph值與振蕩速度以孢子菌懸液為菌種,每個250mL三角瓶中裝入50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)液,接種量2%(mL/mL),初始pH值為5.0,培養(yǎng)溫度為30℃,振蕩速度為150r/min。產(chǎn)酶結(jié)束后,發(fā)酵液于4℃,10000r/min條件下離心30min,取上清液,備用。1.2.3纖維二糖添加量的確定補料及補料量對酶合成的影響:以2%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)3d后在每瓶中分別加入0.25g、0.5g、0.75g、1.0g無菌麩皮干粉(粉碎至60目,稱取所需重量,用鋁箔紙包好,在121℃下濕法滅菌20min)。繼續(xù)培養(yǎng)24h結(jié)束產(chǎn)酶。補料次數(shù)對酶合成的影響:以2%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)3d后開始第一次補料,然后每隔12h補料一次。補加的料分為二組,一組為每次每瓶加入0.5g無菌的麩皮干粉,另一組為每次每瓶加入5%的麩皮浸提液(無菌)10mL。補料4次后繼續(xù)培養(yǎng)24h結(jié)束產(chǎn)酶。不同初始濃度對補料效果的影響:分別以2%、3%、4%、5%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)3d后開始第一次補料,然后每隔24h補料一次。補加的料為每次每瓶加入1.0g無菌麩皮干粉。補料3次后繼續(xù)培養(yǎng)24h結(jié)束產(chǎn)酶。補料順序?qū)ρa料效果的影響:以3%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)3d后開始第一次補料,然后每隔24h補料一次。補加的料為無菌麩皮干粉。補加方式分為三種,A種的第一次、第二次、第三次分別加入0.5g,1.0g,1.5g,B種每次均加1.0g,C種的第一次、第二次、第三次分別加入1.5g,1.0g,0.5g。三種方式的添料總量相同。補料3次后繼續(xù)培養(yǎng)24h結(jié)束產(chǎn)酶。補加纖維二糖對酶合成的影響:以2%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)2d后在每瓶中分別加入終濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1%纖維二糖。然后繼續(xù)培養(yǎng)48h結(jié)束產(chǎn)酶。在研究添加纖維二糖的適宜時間和次數(shù)時,一是分別在產(chǎn)酶的第1d、2d、3d、4d添加2%的纖維二糖,整個產(chǎn)酶過程僅添加1次;二是三組樣品在產(chǎn)酶培養(yǎng)2d時均補料1次,24h后僅第二組、第三組樣品補加1次,48h后僅第三組樣品再補加1次,每次添加1%。以不添加纖維二糖的樣品為空白對照,所有的樣品培養(yǎng)5d后,取樣測發(fā)酵清液中pH值和酶活力大小。1.2.4總還原糖濃度的測定采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)法。1.2.5ph測量使用酸度計測定。1.2.6可可溶性物質(zhì)的測定采用改良的Bradford法測定。1.2.7-葡萄糖酶活性的測定以水楊素(Fluka公司)為底物,定義在最適反應條件下每分鐘催化水解水楊素產(chǎn)生1μmol葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位(U)。2結(jié)果與討論2.1不同補料對-葡萄糖苷酶活力的影響補料及補料量對β-葡萄糖苷酶合成的影響見表1。從表中可知,通過補料,β-葡萄糖苷酶的活力、胞外蛋白的含量都得到了提高。添加1.0%、2.0%麩皮時,β-葡萄糖苷酶的活力由未補料的1.77U/mL分別增加到2.39U/mL和2.57U/mL,胞外蛋白的含量由未補料的0.31mg/mL分別增加到0.41mg/mL和0.42mg/mL。而且,通過補料可以提高發(fā)酵液的pH值,使之有利于β-葡萄糖苷酶的合成。但單次補料時增加麩皮的添加量不能使酶活產(chǎn)生顯著變化,而且一次添加量過大還造成發(fā)酵液中還原糖含量偏高。2.2不同補加液對-葡萄糖苷酶活力的影響為防止補料量過大而使得發(fā)酵液粘度偏大以及最終產(chǎn)酶液中殘留還原糖濃度偏高的狀況,在多次補料的試驗方案中減少了每次補料量,同時縮短了補料的間隔時間。從表2中可知,隨著補加麩皮干粉次數(shù)的增多,酶活不斷增加。經(jīng)過四次補料,酶活由1.72U/mL增加到5.07U/mL,酶活力提高了近3倍。當補加的是麩皮浸提液時,經(jīng)過第三次、第四次補料后,單位體積(mL)酶活力單位由1.72分別增加到2.91和2.80。但由于每次補加麩皮浸提液后發(fā)酵液的總體積隨之增加,所以,考察補料效果的好壞需要根據(jù)發(fā)酵液總酶活的變化情況來定。通過計算可知(表2),第三次、第四次補料麩皮浸提液后發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶總活力由86.07U分別增加到232.41U和251.71U,其結(jié)果與補加麩皮干粉非常接近,說明在麩皮總量相同的情況下,添加麩皮浸提液并不影響β-葡萄糖苷酶的分泌。因此,以2%麩皮為初始碳源時,培養(yǎng)3d后每隔12h補加一次麩皮干粉或麩皮浸提液,連續(xù)補加3～4次比較適宜。2.3補料營養(yǎng)的影響不同初始濃度對補料效果的影響見表3。從表中可知,盡管補料方式一致,但不同的初始濃度對酶的最終活性也有一定的影響。初始的麩皮濃度太低,則在補料前由于營養(yǎng)物質(zhì)的不足限制了微生物的生長、增殖的速度,使得菌絲量減少,甚至細胞開始產(chǎn)生自溶;初始的麩皮濃度太高,雖然培養(yǎng)基的營養(yǎng)豐富,但在培養(yǎng)三天后數(shù)次補料的結(jié)果導致培養(yǎng)基的粘度明顯加大,從而影響到營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶從菌絲內(nèi)擴散到發(fā)酵液中的速度。所以,選擇好適宜的初始麩皮用量十分重要,從試驗結(jié)果來看,3%的麩皮用量比較適宜,其蛋白含量和酶活均為最高,分別達到0.69mg/mL和7.00U/mL。2.4不同補料處理對發(fā)酵液酶活力和還原糖含量的影響補料方式對β-葡萄糖苷酶合成影響較大。從圖1中可知,發(fā)酵6d后,以A、B、C三種方式(詳見材料與方法1.2.3)補料的發(fā)酵液中酶活力分別為6.42U/mL、7.0U/mL、7.34U/mL;還原糖含量分別11.04g/L、7.68g/L、5.82g/L。同時,發(fā)酵液粘稠逐漸變小,菌絲體和酶液的分離也越來越容易。顯然C補料方式最好。2.5纖維二糖添加量的確定以2%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)2d后分別加入終濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1%纖維二糖。然后繼續(xù)培養(yǎng)48h,產(chǎn)酶結(jié)束后取樣分析,結(jié)果見圖2。從圖中可知,纖維二糖對黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶有一定的誘導作用。未添加纖維二糖時,酶活力為1.68U/mL,當添加0.1%、0.2%纖維二糖時,它們的酶活力分別增加到2.08U/mL、2.20U/mL。但當添加量超過0.2%,其誘導作用開始不斷減弱。從酶活的增加幅度來看,本實驗中添加纖維二糖后,誘導作用不是非常顯著,可能與麩皮中本身就含有少量纖維二糖或類似纖維二糖的誘導物有關(guān)。但結(jié)果表明,較低濃度的纖維二糖有利于β-葡萄糖苷酶的分泌,而高濃度的纖維二糖誘導作用不明顯甚至有抑制作用。纖維二糖的添加時間和次數(shù)對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響見表4。從表中可知,發(fā)酵過程中,當添加纖維二糖的次數(shù)僅為一次時,于接種培養(yǎng)后第2d添加比較適宜,此時酶活力最高,達到2.69U/mL;采用分批添加纖維二糖時,在接種培養(yǎng)后的第2d、第3d分別添加0.1%纖維二糖效果較好。當連續(xù)三天分別添加0.1%纖維二糖,酶活力為該試驗組中最低值,僅為1.92U/mL。從圖2和表4中還發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液的pH值隨著纖維二糖濃度的增加呈下降趨勢。這是因為隨著纖維二糖濃度的增加,β-葡萄糖苷酶可以水解纖維二糖生成更多的葡萄糖。而本實驗使用的黑曲霉菌株在以葡萄糖為碳源的發(fā)酵過程中,發(fā)酵液的pH下降很快,當產(chǎn)酶周期為5d時,發(fā)酵液的pH值能下降到2.5左右(文章還未發(fā)表)。所以,以纖維二糖為誘導物誘導β-葡萄糖苷酶時,其補加的量及補加的時間尤為重要。試驗結(jié)果表明,在接種培養(yǎng)后的第2d添加0.2%纖維二糖比較適宜。3麩皮、纖維二糖對黑曲霉酶的影響3.1補料、補料量及補料次數(shù)影響著黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量。經(jīng)過四次補加1%麩皮干粉,酶活力由未補料的1.72U/mL增加到5.07U/mL,提高了近3倍。而且,添加麩皮浸提液能達到同樣效果。3.2采用