黑曲霉發(fā)酵-葡萄糖苷酶補(bǔ)料工藝研究

黑曲霉發(fā)酵-葡萄糖苷酶補(bǔ)料工藝研究

-葡萄糖苷酶是纖維素酶的重要酶成分之一。在木霉纖維素酶水解天然纖維素的過程中,添加外源β-葡萄糖苷酶是降低水解液中纖維素二糖積累量、提高酶解得率的有效方法之一。此外,β-葡萄糖苷酶可作為風(fēng)味酶應(yīng)用于(果)酒、茶葉、果汁中起到增香作用;可應(yīng)用于乳品工業(yè)中分解乳糖;也可應(yīng)用于催化葡萄糖發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)和縮合反應(yīng)合成功能性低聚糖等。因此,高活力、低成本的β-葡萄糖苷酶制備技術(shù)已成為國內(nèi)外在這些領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。分批補(bǔ)料發(fā)酵是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù),指在微生物分批發(fā)酵中,以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加一定物料的培養(yǎng)技術(shù)。通過向培養(yǎng)系統(tǒng)中補(bǔ)充物料,可以使培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物濃度較長時(shí)間地保持在一定范圍內(nèi),既保證微生物的生長需要,又不造成不利影響,從而達(dá)到提高產(chǎn)率的目的。β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)和其他酶制劑一樣,高濃度的液體深層發(fā)酵會對菌體的生長和代謝物的分泌產(chǎn)生抑制作用。所以,一次性添加大量營養(yǎng)物質(zhì)不利于產(chǎn)酶,而將營養(yǎng)分批加入可以解除營養(yǎng)基質(zhì)本身帶來的抑制作用及其代謝積累產(chǎn)物的反饋抑制作用以及葡萄糖分解阻遏效應(yīng)。另一方面,β-葡萄糖苷酶是一種誘導(dǎo)酶,但誘導(dǎo)物的濃度及誘導(dǎo)時(shí)間影響著誘導(dǎo)能力。作者以麩皮和纖維二糖為補(bǔ)加物料,研究了補(bǔ)料量、補(bǔ)料次數(shù)、發(fā)酵基料中麩皮的初始濃度及補(bǔ)料方式對黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶的影響,以期達(dá)到大幅度提高β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的目的。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗(yàn)中的細(xì)菌A.nigernl-1由南京林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。4℃保存在PDA平板培養(yǎng)基中。1.1.2馬鈴薯、蔗糖、脂馬鈴薯斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。其中,馬鈴薯20%,蔗糖2%,瓊脂2%。液體發(fā)酵基本培養(yǎng)基采用改進(jìn)的Vogel培養(yǎng)基,即碳源使用4%的麩皮。1.2準(zhǔn)備和檢測方法1.2.1制備芽孢桿菌菌懸液將菌種在無菌條件下接入PDA平板培養(yǎng)基中,置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7d。菌株待孢子長滿斜面后用無菌水制成孢子菌懸液。其中,孢子含量為4×106個/mL。1.2.2初始ph值與振蕩速度以孢子菌懸液為菌種,每個250mL三角瓶中裝入50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)液,接種量2%(mL/mL),初始pH值為5.0,培養(yǎng)溫度為30℃,振蕩速度為150r/min。產(chǎn)酶結(jié)束后,發(fā)酵液于4℃,10000r/min條件下離心30min,取上清液,備用。1.2.3纖維二糖添加量的確定補(bǔ)料及補(bǔ)料量對酶合成的影響:以2%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)3d后在每瓶中分別加入0.25g、0.5g、0.75g、1.0g無菌麩皮干粉(粉碎至60目,稱取所需重量,用鋁箔紙包好,在121℃下濕法滅菌20min)。繼續(xù)培養(yǎng)24h結(jié)束產(chǎn)酶。補(bǔ)料次數(shù)對酶合成的影響:以2%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)3d后開始第一次補(bǔ)料,然后每隔12h補(bǔ)料一次。補(bǔ)加的料分為二組,一組為每次每瓶加入0.5g無菌的麩皮干粉,另一組為每次每瓶加入5%的麩皮浸提液(無菌)10mL。補(bǔ)料4次后繼續(xù)培養(yǎng)24h結(jié)束產(chǎn)酶。不同初始濃度對補(bǔ)料效果的影響:分別以2%、3%、4%、5%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)3d后開始第一次補(bǔ)料,然后每隔24h補(bǔ)料一次。補(bǔ)加的料為每次每瓶加入1.0g無菌麩皮干粉。補(bǔ)料3次后繼續(xù)培養(yǎng)24h結(jié)束產(chǎn)酶。補(bǔ)料順序?qū)ρa(bǔ)料效果的影響:以3%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)3d后開始第一次補(bǔ)料,然后每隔24h補(bǔ)料一次。補(bǔ)加的料為無菌麩皮干粉。補(bǔ)加方式分為三種,A種的第一次、第二次、第三次分別加入0.5g,1.0g,1.5g,B種每次均加1.0g,C種的第一次、第二次、第三次分別加入1.5g,1.0g,0.5g。三種方式的添料總量相同。補(bǔ)料3次后繼續(xù)培養(yǎng)24h結(jié)束產(chǎn)酶。補(bǔ)加纖維二糖對酶合成的影響:以2%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)2d后在每瓶中分別加入終濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1%纖維二糖。然后繼續(xù)培養(yǎng)48h結(jié)束產(chǎn)酶。在研究添加纖維二糖的適宜時(shí)間和次數(shù)時(shí),一是分別在產(chǎn)酶的第1d、2d、3d、4d添加2%的纖維二糖,整個產(chǎn)酶過程僅添加1次;二是三組樣品在產(chǎn)酶培養(yǎng)2d時(shí)均補(bǔ)料1次,24h后僅第二組、第三組樣品補(bǔ)加1次,48h后僅第三組樣品再補(bǔ)加1次,每次添加1%。以不添加纖維二糖的樣品為空白對照,所有的樣品培養(yǎng)5d后,取樣測發(fā)酵清液中pH值和酶活力大小。1.2.4總還原糖濃度的測定采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)法。1.2.5ph測量使用酸度計(jì)測定。1.2.6可可溶性物質(zhì)的測定采用改良的Bradford法測定。1.2.7-葡萄糖酶活性的測定以水楊素(Fluka公司)為底物,定義在最適反應(yīng)條件下每分鐘催化水解水楊素產(chǎn)生1μmol葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位(U)。2結(jié)果與討論2.1不同補(bǔ)料對-葡萄糖苷酶活力的影響補(bǔ)料及補(bǔ)料量對β-葡萄糖苷酶合成的影響見表1。從表中可知,通過補(bǔ)料,β-葡萄糖苷酶的活力、胞外蛋白的含量都得到了提高。添加1.0%、2.0%麩皮時(shí),β-葡萄糖苷酶的活力由未補(bǔ)料的1.77U/mL分別增加到2.39U/mL和2.57U/mL,胞外蛋白的含量由未補(bǔ)料的0.31mg/mL分別增加到0.41mg/mL和0.42mg/mL。而且,通過補(bǔ)料可以提高發(fā)酵液的pH值,使之有利于β-葡萄糖苷酶的合成。但單次補(bǔ)料時(shí)增加麩皮的添加量不能使酶活產(chǎn)生顯著變化,而且一次添加量過大還造成發(fā)酵液中還原糖含量偏高。2.2不同補(bǔ)加液對-葡萄糖苷酶活力的影響為防止補(bǔ)料量過大而使得發(fā)酵液粘度偏大以及最終產(chǎn)酶液中殘留還原糖濃度偏高的狀況,在多次補(bǔ)料的試驗(yàn)方案中減少了每次補(bǔ)料量,同時(shí)縮短了補(bǔ)料的間隔時(shí)間。從表2中可知,隨著補(bǔ)加麩皮干粉次數(shù)的增多,酶活不斷增加。經(jīng)過四次補(bǔ)料,酶活由1.72U/mL增加到5.07U/mL,酶活力提高了近3倍。當(dāng)補(bǔ)加的是麩皮浸提液時(shí),經(jīng)過第三次、第四次補(bǔ)料后,單位體積(mL)酶活力單位由1.72分別增加到2.91和2.80。但由于每次補(bǔ)加麩皮浸提液后發(fā)酵液的總體積隨之增加,所以,考察補(bǔ)料效果的好壞需要根據(jù)發(fā)酵液總酶活的變化情況來定。通過計(jì)算可知(表2),第三次、第四次補(bǔ)料麩皮浸提液后發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶總活力由86.07U分別增加到232.41U和251.71U,其結(jié)果與補(bǔ)加麩皮干粉非常接近,說明在麩皮總量相同的情況下,添加麩皮浸提液并不影響β-葡萄糖苷酶的分泌。因此,以2%麩皮為初始碳源時(shí),培養(yǎng)3d后每隔12h補(bǔ)加一次麩皮干粉或麩皮浸提液,連續(xù)補(bǔ)加3～4次比較適宜。2.3補(bǔ)料營養(yǎng)的影響不同初始濃度對補(bǔ)料效果的影響見表3。從表中可知,盡管補(bǔ)料方式一致,但不同的初始濃度對酶的最終活性也有一定的影響。初始的麩皮濃度太低,則在補(bǔ)料前由于營養(yǎng)物質(zhì)的不足限制了微生物的生長、增殖的速度,使得菌絲量減少,甚至細(xì)胞開始產(chǎn)生自溶;初始的麩皮濃度太高,雖然培養(yǎng)基的營養(yǎng)豐富,但在培養(yǎng)三天后數(shù)次補(bǔ)料的結(jié)果導(dǎo)致培養(yǎng)基的粘度明顯加大,從而影響到營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶從菌絲內(nèi)擴(kuò)散到發(fā)酵液中的速度。所以,選擇好適宜的初始麩皮用量十分重要,從試驗(yàn)結(jié)果來看,3%的麩皮用量比較適宜,其蛋白含量和酶活均為最高,分別達(dá)到0.69mg/mL和7.00U/mL。2.4不同補(bǔ)料處理對發(fā)酵液酶活力和還原糖含量的影響補(bǔ)料方式對β-葡萄糖苷酶合成影響較大。從圖1中可知,發(fā)酵6d后,以A、B、C三種方式(詳見材料與方法1.2.3)補(bǔ)料的發(fā)酵液中酶活力分別為6.42U/mL、7.0U/mL、7.34U/mL;還原糖含量分別11.04g/L、7.68g/L、5.82g/L。同時(shí),發(fā)酵液粘稠逐漸變小,菌絲體和酶液的分離也越來越容易。顯然C補(bǔ)料方式最好。2.5纖維二糖添加量的確定以2%麩皮為初始碳源,培養(yǎng)2d后分別加入終濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1%纖維二糖。然后繼續(xù)培養(yǎng)48h,產(chǎn)酶結(jié)束后取樣分析,結(jié)果見圖2。從圖中可知,纖維二糖對黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶有一定的誘導(dǎo)作用。未添加纖維二糖時(shí),酶活力為1.68U/mL,當(dāng)添加0.1%、0.2%纖維二糖時(shí),它們的酶活力分別增加到2.08U/mL、2.20U/mL。但當(dāng)添加量超過0.2%,其誘導(dǎo)作用開始不斷減弱。從酶活的增加幅度來看,本實(shí)驗(yàn)中添加纖維二糖后,誘導(dǎo)作用不是非常顯著,可能與麩皮中本身就含有少量纖維二糖或類似纖維二糖的誘導(dǎo)物有關(guān)。但結(jié)果表明,較低濃度的纖維二糖有利于β-葡萄糖苷酶的分泌,而高濃度的纖維二糖誘導(dǎo)作用不明顯甚至有抑制作用。纖維二糖的添加時(shí)間和次數(shù)對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響見表4。從表中可知,發(fā)酵過程中,當(dāng)添加纖維二糖的次數(shù)僅為一次時(shí),于接種培養(yǎng)后第2d添加比較適宜,此時(shí)酶活力最高,達(dá)到2.69U/mL;采用分批添加纖維二糖時(shí),在接種培養(yǎng)后的第2d、第3d分別添加0.1%纖維二糖效果較好。當(dāng)連續(xù)三天分別添加0.1%纖維二糖,酶活力為該試驗(yàn)組中最低值,僅為1.92U/mL。從圖2和表4中還發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液的pH值隨著纖維二糖濃度的增加呈下降趨勢。這是因?yàn)殡S著纖維二糖濃度的增加,β-葡萄糖苷酶可以水解纖維二糖生成更多的葡萄糖。而本實(shí)驗(yàn)使用的黑曲霉菌株在以葡萄糖為碳源的發(fā)酵過程中,發(fā)酵液的pH下降很快,當(dāng)產(chǎn)酶周期為5d時(shí),發(fā)酵液的pH值能下降到2.5左右(文章還未發(fā)表)。所以,以纖維二糖為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)β-葡萄糖苷酶時(shí),其補(bǔ)加的量及補(bǔ)加的時(shí)間尤為重要。試驗(yàn)結(jié)果表明,在接種培養(yǎng)后的第2d添加0.2%纖維二糖比較適宜。3麩皮、纖維二糖對黑曲霉酶的影響3.1補(bǔ)料、補(bǔ)料量及補(bǔ)料次數(shù)影響著黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量。經(jīng)過四次補(bǔ)加1%麩皮干粉,酶活力由未補(bǔ)料的1.72U/mL增加到5.07U/mL,提高了近3倍。而且,添加麩皮浸提液能達(dá)到同樣效果。3.2采用