大容量血樣分離外周血單個(gè)核細(xì)胞方法的探索

大容量血樣分離外周血單個(gè)核細(xì)胞方法的探索

采用percoll法分離水生單胞菌（pbmc），并對(duì)percoll可接近性學(xué)說(shuō)進(jìn)行分離。但較大容量血樣,如50-200ml全血,無(wú)菌分離PBMC時(shí),則須分成多個(gè)離心管,操作煩瑣且重復(fù)地開(kāi)放性操作容易導(dǎo)致污染。而血細(xì)胞分離機(jī)分離PBMC費(fèi)用貴、需專業(yè)醫(yī)師和設(shè)備,且血細(xì)胞分離機(jī)很少配備于科研室。當(dāng)需要大量從外周血無(wú)菌分離PBMC以培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞、細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞等進(jìn)行相關(guān)研究或免疫生物治療時(shí),分離PBMC成為原理簡(jiǎn)單明晰但操作煩瑣費(fèi)力的科研步驟。根據(jù)全血中不同血細(xì)胞的密度以及密度梯度離心法的原理,經(jīng)過(guò)多次嘗試,本項(xiàng)目組探索出“大容量全血簡(jiǎn)易無(wú)菌PBMC分離法”即多次稀釋并離心抗凝血,取血漿與紅細(xì)胞交界層(富含PBMC),再用經(jīng)典的聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離交界層獲取PBMC的方法。此方法使缺乏血細(xì)胞分離機(jī)的普通實(shí)驗(yàn)室,能夠簡(jiǎn)單安全地從大量血樣中無(wú)菌分離PBMC。1材料方法1.1胞分層液及顯微鏡聚蔗糖-泛影葡胺分層液(也稱淋巴細(xì)胞分層液)為上海試劑二廠產(chǎn)品;顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品;微量移液器為Eppendorf公司產(chǎn)品。1.2小組抗凝外周血10ml×5份,每份均分為A和B兩管,每管各5ml,得A、B兩組,兩組分別按照經(jīng)典法和新方法分離PBMC。1.3經(jīng)典法與pbmc分離PBS對(duì)倍稀釋A組各管全血后加樣于5ml淋巴細(xì)胞分層液上,2500r/min離心20min,吸取PBMC層。1.4分離pbmcB組各管先1200r/min離心10min,取出血漿與紅細(xì)胞的交界層約1ml(要刻意吸取部分血漿以充分稀釋交界層內(nèi)豐富的白細(xì)胞),按照經(jīng)典方法分離其中PBMC,即加樣于大于1/2量的淋巴細(xì)胞分層液上,2500r/min離心20min,吸取PBMC層。取走交界層后的余留血液補(bǔ)加適量PBS、混勻、再次1200r/min離心10min取交界層,再次經(jīng)典法分離交界層獲取PBMC。1.5棄上清操作洗滌1.3、1.4獲得的PBMCs3次,即加適量PBS、混勻、1000r/min離心10min棄上清,重復(fù)操作3次。加PBS懸浮起各管細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染液染色,10倍物鏡下計(jì)數(shù)并計(jì)算各管細(xì)胞總數(shù)及活細(xì)胞百分率。1.6統(tǒng)計(jì)分析1.7分離原理及分離無(wú)菌采集HLA-A*0201陽(yáng)性健康供者外周抗凝血100ml,1000r/min離心血袋10min取血漿與紅細(xì)胞交界層的細(xì)胞約4-6ml,生理鹽水對(duì)倍稀釋后加于5ml淋巴細(xì)胞分層液上層,2500r/min離心20min,取PBMC層。取走交界層后的血袋補(bǔ)加適量生理鹽水、混勻、再次離心取血漿與紅細(xì)胞交界層,然后用經(jīng)典方法分離交界層獲取PBMC?；蛘吆喜纱坞x心血袋所得的交界層,在50ml大號(hào)離心管內(nèi)用經(jīng)典方法一次分離交界層,獲取PBMC。2結(jié)果2.1細(xì)胞計(jì)數(shù)和活細(xì)胞比例臺(tái)盼藍(lán)染色后在視野較寬的100倍鏡下(10倍物鏡)計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞百分比?；罴?xì)胞光亮無(wú)色,死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色且細(xì)胞發(fā)暗、無(wú)光澤,見(jiàn)圖1(見(jiàn)第284頁(yè))。兩種方法所得的PBMC,活細(xì)胞均占細(xì)胞總數(shù)的96%以上。2.3pb-不育血液樣本的制備多次運(yùn)用新方法從100ml抗凝血中分離PBMC并培養(yǎng)DC獲得成功,證明此方法不影響所得細(xì)胞的活性。3血液中pbmc分離經(jīng)典分離法是稀釋抗凝血使血細(xì)胞充分分散后加于比重為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液上,在離心力的作用下,由管底到管頂依次是比重最大的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分層液、PBMC(包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)、血漿和等滲稀釋液(含血小板)。同樣,由于比重不同,抗凝全血經(jīng)離心后,將會(huì)按照比重大小依次分布為紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、PBMC、血漿(含血小板)層。只是各層細(xì)胞間缺乏分層液的間隔,層次分界不清。取出血漿與紅細(xì)胞間富集PBMC的交界層即可達(dá)到減少血樣的目的,使分離大容量血樣品中PBMC的方法大為簡(jiǎn)化。由表1可看出,新方法首次分離得到的PBMC低于經(jīng)典方法(P<0.05),是經(jīng)典法的84.66%-99.17%。這說(shuō)明新方法首次分離后至少余留7.50%-21.74%的PBMC在血液中。這可能與部分PBMC間夾在紅細(xì)胞間下沉,不位于血漿與紅細(xì)胞交界層有關(guān),這可能通過(guò)充分稀釋、分散血細(xì)胞得以改善。經(jīng)過(guò)充分稀釋、離心、再次分離交界層后,得到的PBMC僅是經(jīng)典方法的6.92%-18.41%。但是經(jīng)過(guò)兩次分離后,新方法總共得到的PBMC總數(shù)不低于經(jīng)典法(P>0.05)。所以遇到血液量大、又需要無(wú)菌操作時(shí),可選用這種先離心取出交界層,再淋巴細(xì)胞分層液分離交界層的方法。新方法與經(jīng)典分離法相比,不僅可大量節(jié)省淋巴細(xì)胞分層液和無(wú)菌實(shí)驗(yàn)器材,而且操作簡(jiǎn)便,使開(kāi)放性操作導(dǎo)致污染的機(jī)會(huì)減少,從而使缺乏血細(xì)胞分離機(jī)的普通實(shí)驗(yàn)室,能夠簡(jiǎn)單安全地從大容量血樣中無(wú)菌分離PBMC。另外,新方法可在封閉的血袋或輸液瓶中離心得到交界層,分離完P(guān)BMC后的血液尚可回輸機(jī)體再利用,因而更適用于僅需獲取PBMC的免疫生物治療或研究。本項(xiàng)目組多次運(yùn)用新方法從100ml抗凝血中分離PBMC并培養(yǎng)DC獲得成功,證明此方法不影響所得細(xì)胞的功能或活性。外周血PBMC總數(shù)在(1.52-3.8)×106/ml,受試劑、分離操作過(guò)程、細(xì)胞洗滌丟失等的影響,經(jīng)典分離法一般很少能達(dá)到(2-4)×106/ml。不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作者所得PBMC數(shù)量也有差別,Schlenke等從8ml外周血中分離得到1.09×107個(gè)PB-MC,平均1.36×106/ml,而Ruitenberg等在加大淋巴細(xì)胞分層液用量、加倍稀釋全血的情況下得量達(dá)到2.98×106/ml。本項(xiàng)目組用經(jīng)典分離法的得量在1.21×106-1.63×106/ml。但是本項(xiàng)目組在同等條件下比較兩種方法的PBMC得量,最大程度避