煙草主流煙氣中氫氰酸釋放量的預(yù)測模型

煙草主流煙氣中氫氰酸釋放量的預(yù)測模型

1卷煙煙氣的化學(xué)組成氫氰酸（hcn）是卷煙中最具毒性的藥物，對人類非常有害。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將氫氰酸作為最有毒的卷煙吸入氣體。研究學(xué)者在通過裂解氫氰酸的可能前體物來研究氫氰酸的形成機(jī)理方面做了大量研究工作,并有研究報(bào)道卷煙煙氣中的氰化氫主要來自于煙草中的蛋白質(zhì)、氨基酸和硝酸鹽的轉(zhuǎn)化,特別是甘氨酸、脯氨酸及氨基二羧酸的熱解。然而,煙草包含化合物的種類非常多,在燃吸過程中物質(zhì)之間會發(fā)生相互作用,導(dǎo)致單純裂解模式和卷煙的實(shí)際燃燒情況差別較大,不能真實(shí)地反映卷煙煙氣的化學(xué)組成。隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展,它在煙草研究領(lǐng)域的應(yīng)用變得非常廣泛,但利用化學(xué)計(jì)量學(xué)手段研究煙葉中游離態(tài)氨基酸與煙氣中氫氰酸的關(guān)系的詳細(xì)報(bào)道較為少見,為此,本文研究了煙葉中16種游離態(tài)氨基酸和煙氣中氫氰酸的描述性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以及氨基酸與卷煙煙氣中HCN釋放量的相關(guān)性,探究了影響HCN釋放量的主要氨基酸,從而期望達(dá)到利用煙葉原料控制卷煙煙氣中HCN釋放量的目的,為卷煙減害降焦提供科學(xué)依據(jù)。2實(shí)驗(yàn)部分2.1氨基酸儀器流動相18種氨基酸混標(biāo)(10、25、100、250、1000pmol/μL,德國Sigma公司)[天冬氨酸(ASP)、蘇氨酸(THR)、絲氨酸(SER)、甘氨酸(GLY)、丙氨酸(ALA)、纈氨酸(VAL)、胱氨酸(Cystine,縮寫為CYS)、異亮氨酸(ILE)、亮氨酸(LEU)、賴氨酸(LYS)、精氨酸(ARG)、谷氨酸(GLU)、蛋氨酸(MET)、酪氨酸(TYR)、苯丙氨酸(PHE)、組氨酸(HIS)、脯氨酸(PRO),色氨酸(TRP)];氨基酸分析儀流動相(德國Syknm公司);濃鹽酸(分析純,上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司);氰離子(CN-)標(biāo)準(zhǔn)溶液(17mg/L,國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),中國計(jì)量科學(xué)研究院),50%氫氧化鈉溶液(比利時(shí)AcrosOrganics公司),醋酸鈉(比利時(shí)AcrosOrganics公司);氫氧化鈉(分析純,北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。S-433D型氨基酸分析儀(德國Syknm公司);JK-DY500型超聲波清洗器(合肥金尼克有限公司);2-16型離心機(jī)(德國Sigma公司);ICS-3000型離子色譜系統(tǒng)(美國Dionex公司),包含四元梯度泵,ED3000電化學(xué)檢測器、AS40自動進(jìn)樣器,Ag參比電極,Ag/AgCl對電極,鈦電極,IonPacAS7分析柱(4mm×250mm),保護(hù)柱(4mm×50mm);RM20H型吸煙機(jī)(德國博瓦特-凱西公司),Milli-Q型超純水發(fā)生器(法國MilliPore公司)。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1單料煙卷煙的制作60種單料煙煙葉及單料煙卷煙樣品均由安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供,單料煙用機(jī)制方法在同一臺卷煙設(shè)備上卷制成60種單料煙卷煙,卷煙煙支樣品的規(guī)格、原輔材料保持一致。煙樣樣品在40℃烘箱中干燥平衡3h后磨碎,過40目篩收集,收集的樣品保存在溫度為(22±2)℃、相對濕度為(60±5)%的環(huán)境中。2.2.2超聲萃取與氨基酸分析準(zhǔn)確稱取1.000g煙末樣品置于50mL錐形瓶中,加入20mL0.05mol/LHCl,室溫下超聲萃取30min,11000r/min下離心10min,上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾,濾液待氨基酸分析儀分析。由于氨基酸分析儀測定氨基酸時(shí)THR和SER、ILE和LEU的分離度不理想,本實(shí)驗(yàn)中用THR代表THR和SER含量之和,LEU代表ILE和LEU含量之和。2.2.3氫氰酸是測定氣體中常見香煙的關(guān)鍵卷煙主流煙氣中氫氰酸的測定參照文獻(xiàn)。2.2.4處理數(shù)據(jù)所有數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)均采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。數(shù)據(jù)處理包括描述性統(tǒng)計(jì)分析、相關(guān)性分析和線性回歸方程的建立。3結(jié)果與討論3.1煙臺市氨基酸分布及含量采用2.2.2節(jié)中的方法,測定了60個(gè)烤煙型單料煙煙葉中16種氨基酸的含量,對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明烤煙型單料煙中各種氨基酸含量的變異系數(shù)較大,都超過20%,說明不同地區(qū)、不同品種、不同部位的煙葉中氨基酸含量差異較大,本實(shí)驗(yàn)中THR、GLU、ALA、CYS、VAL、MET、HIS、TRP、ARG峰度值位于1—3之間,說明數(shù)據(jù)的分布比較適中,其他氨基酸的峰為非常態(tài)峰。THR、VAL、LEU的偏度值小于0,說明呈負(fù)偏態(tài),其余氨基酸的偏度值大于0,呈正偏態(tài)。煙葉中游離態(tài)氨基酸的總量呈現(xiàn)明顯的部位特征,從上部煙葉到下部煙葉氨基酸的含量逐漸降低(僅有個(gè)別氨基酸其含量表現(xiàn)為下部煙葉含量大于中部煙葉);另外,上部煙葉與中部煙葉的氨基酸含量差距較大,而下部煙葉和中部煙葉氨基酸含量較為接近,這一規(guī)律可以解釋為不同部位煙葉在生長期所處的外部環(huán)境不同,所以氨基酸的含量存在差異。由于上部煙葉處于強(qiáng)光照條件下時(shí)間較長,合成積累干物質(zhì)多,如蛋白質(zhì)等,在煙葉調(diào)制、加工過程中蛋白質(zhì)分解得到較多的游離態(tài)氨基酸,因此上部煙葉氨基酸的含量明顯高于中部和下部煙葉。3.2氰酸含量的變幅采用離子色譜-脈沖安培檢測法測定了60種單料煙主流煙氣中HCN的含量,對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見表1。結(jié)果表面,煙氣中氫氰酸含量的變幅在154.0—321.0μg/支之間,平均值為215.9μg/支,標(biāo)準(zhǔn)差為38.37μg/支,變異系數(shù)為17.77%,峰度值(0.365)小于1,說明數(shù)據(jù)的分布比標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布更平緩,為平峰分布。偏度值(0.819)大于0,表示正偏差值大,為正偏。氫氰酸的釋放量也呈現(xiàn)上部煙葉大于下部和中部煙葉的趨勢,這說明氨基酸和卷煙煙氣中氫氰酸的釋放量可能存在一定的內(nèi)在關(guān)系。3.3氨基酸活性成分與hcn的關(guān)系國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)指出,卷煙煙氣中的HCN取決于煙草中硝酸鹽、蛋白質(zhì)和氨基酸的含量。通過裂解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),煙葉中的某些氨基酸在加熱時(shí)可產(chǎn)生HCN,是卷煙煙氣中HCN的可能前體物,但實(shí)驗(yàn)沒有明確指出哪些氨基酸會顯著影響HCN的生成。為此,本文研究了HCN與16種游離態(tài)氨基酸之間的相關(guān)系數(shù),并結(jié)合前人研究結(jié)果探討卷煙主流煙氣中氫氰酸的形成機(jī)理。煙葉游離態(tài)氨基酸與煙氣氫氰酸釋放量的相關(guān)性分析見表2。由表2知,16種氨基酸中有8種(蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸和脯氨酸)與卷煙主流煙氣氫氰酸顯著相關(guān)。16種氨基酸除亮氨酸與氫氰酸呈負(fù)相關(guān)外,其他氨基酸與氫氰酸均呈現(xiàn)正相關(guān)。8種有相關(guān)性的氨基酸中蘇氨酸和賴氨酸在0.05水平正相關(guān),另外6種氨基酸在0.01水平正相關(guān),由于P都小于顯著性水平0.05,因此具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有堿性氨基酸(包括精氨酸、組氨酸和賴氨酸)都與HCN釋放量呈顯著正相關(guān),但是所有酸性氨基酸與HCN釋放量都沒有顯著相關(guān)性。這可以用卷煙燃燒過程中氨基酸裂解生成HCN的機(jī)理來解釋,裂解過程中氨基酸先歷經(jīng)去氨基和去羧基過程,兩個(gè)氨基酸再結(jié)合形成哌嗪二酮,然后主要裂解形成亞胺(RCH==NH)(RCΗ=ΝΗ),亞胺經(jīng)過脫氫作用形成烷基腈(RCH==N?)(RCΗ=Ν-)或經(jīng)過脫烷基作用形成HCN。因此容易成環(huán)的氨基酸及本身含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)或能夠形成環(huán)狀中間體的氨基酸是形成HCN的主要氨基酸。此外,烤煙中的堿性氨基酸與卷煙煙氣中HCN顯著正相關(guān),這與HaidarNF等人的結(jié)論一致,這可能是由于堿性的賴氨酸分子中含氮量較高,或者賴氨酸裂解形成了嘧啶或哌啶等中間產(chǎn)物,這些中間產(chǎn)物都易形成HCN。雜環(huán)氨基酸(色氨酸和脯氨酸)與氫氰酸釋放量都成顯著正相關(guān),這一結(jié)果與含氮環(huán)狀化合物在高溫裂解時(shí)能夠產(chǎn)生大量HCN的結(jié)論是一致的,并且含氮雜環(huán)化合物包括哌嗪具有形成HCN的趨勢也是眾所周知的。除堿性氨基酸和雜環(huán)氨基酸外,還有三種氨基酸(苯丙氨酸、丙氨酸和蘇氨酸)與氫氰酸釋放量呈顯著正相關(guān)。JohnsonWR等在1000℃氦氣環(huán)境中裂解了絲氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸6種氨基酸,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)裂解1mol上述氨基酸生成HCN的量依次為:0.45、0.43、0.32、0.12、0.08mol和0.08mol,這說明裂解絲氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸都會產(chǎn)生較多的HCN,與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較一致,且文獻(xiàn)對色氨酸和苯丙氨酸裂解產(chǎn)生大量HCN的現(xiàn)象也無法作出推論,因此這兩種氨基酸的裂解機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。在實(shí)驗(yàn)中蘇氨酸與氫氰酸的相關(guān)系數(shù)為0.2736,而蘇氨酸的含量代表蘇氨酸和絲氨酸的含量之和,可以推斷絲氨酸對該相關(guān)系數(shù)貢獻(xiàn)較大。通過上述相關(guān)性系數(shù)分析,我們可以得出這樣的結(jié)論,對卷煙主流煙氣中HCN釋放量起主要作用的氨基酸依次是:苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸、丙氨酸、脯氨酸和絲氨酸。3.4回歸模型的建立以16種氨基酸作自變量,氫氰酸作因變量,多元線性回歸得到的方程如下:Y=153.327+371.221X1+8889.12X2-2282.36X3式中:Y——HCN含量,變量X1——苯丙氨酸含量,變量X2——胱氨酸含量,變量X3——纈氨酸含量。對回歸方程進(jìn)行F檢驗(yàn)和對方程系數(shù)進(jìn)行T檢驗(yàn),結(jié)果表明所選回歸數(shù)學(xué)模型達(dá)到顯著性水平(可著性=0.000,即P=0.000<0.05),回歸數(shù)學(xué)模型系數(shù)的顯著性也均小于0.05,因此此回歸模型及所有系數(shù)都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)r=0.7901,復(fù)相關(guān)系數(shù)r2=0.6242,這表示回歸方程可以解釋整個(gè)因變量變異程度的62.42%,由于復(fù)相關(guān)系數(shù)沒有達(dá)到90%以上,說明還存在其他前體物會影響HCN的釋放量,如蛋白質(zhì)、煙堿等含氮化合物,該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)較低,用來預(yù)測HCN的釋放量誤差較大,因此需要綜合考慮煙草中其它內(nèi)源性物質(zhì)的影響來建立模型。另外,通過回歸方程分析發(fā)現(xiàn),對HCN釋放量影響較大的依次為苯丙氨酸、胱氨酸和纈氨酸。4其它前體物對hcn釋放量的影響通過對60種單料煙煙葉中游離態(tài)氨基酸的變異分析表明,單料煙煙葉氨基酸的含量存在明顯差異,16種氨基酸中有8種與氫氰酸的釋放量呈顯著正相關(guān),其中包括所有堿性氨基酸和雜環(huán)氨基酸,另外苯丙氨酸、丙氨酸和蘇氨酸也與氫氰酸呈顯著正相關(guān),所有酸性