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認(rèn)證類型：個(gè)人認(rèn)證

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高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人血漿中氫氯噻嗪和奧美沙坦?jié)舛?/p>

奧美沙坦氫氯仿錠體（奧美沙坦）是治療高血壓和充血性心力衰竭的前體藥物。奧美沙坦是一種早期藥物，通過(guò)胃腸道吸收和溶解后呈奧美沙坦。這是一種選擇性的血管緊張素1（at1）抗劑。它可以選擇性地阻斷血管緊張素和血管平滑肌1的結(jié)合，阻止血管緊張素收縮血管，并發(fā)揮降壓作用。氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide)為利尿藥,與奧美沙坦合用能有效地降低輕、中度高血壓患者的血壓,降低不良反應(yīng)發(fā)生率。為了配合其藥動(dòng)學(xué)及臨床合理用藥等研究,我們建立了同時(shí)測(cè)定人血漿中氫氯噻嗪和奧美沙坦?jié)舛鹊腍PLC法,并進(jìn)一步應(yīng)用該方法測(cè)定健康受試者服藥后血漿中氫氯噻嗪和奧美沙坦的濃度。1材料和方法1.1儀器、試劑和儀器1100系列高效液相色譜儀(G1311A四元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1322A在線脫氣機(jī)、G1316A柱溫箱、G1315B二極管陣列檢測(cè)器)(美國(guó)Agilent公司);電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器有限公司);WH-3型旋渦混勻器(上海滬西儀器分析廠)。氫氯噻嗪(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)100309-200001);奧美沙坦(含量>99.4%,北京聯(lián)本醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司);坎地沙坦(含量>99.5%,珠海聯(lián)邦藥業(yè)有限公司);乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher試劑公司);奧美沙坦氫氯噻嗪片(廣西南寧利康醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào)20081116,規(guī)格:每片含奧美沙坦酯20mg,氫氯噻嗪12.5mg);甲基叔丁基醚(色譜純,美國(guó)Fisher試劑公司);實(shí)驗(yàn)用水為重蒸水;其他試劑均為分析純。1.2溶液的制備1.2.1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取氫氯噻嗪對(duì)照品64.0mg,用甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中,配成質(zhì)量濃度為1.28g·L-1的氫氯噻嗪對(duì)照品儲(chǔ)備液,再以流動(dòng)相稀釋成含氫氯噻嗪質(zhì)量濃度為12.8、9.6、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取奧美沙坦對(duì)照品50.0mg,用甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中,配成質(zhì)量濃度為1.0g·L-1的奧美沙坦儲(chǔ)備液,再以流動(dòng)相稀釋成含奧美沙坦質(zhì)量濃度為80、40、20、10、4、2、1、0.4、0.2mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.2.3內(nèi)標(biāo)溶液配制精密稱取坎地沙坦對(duì)照品10.0mg,用甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中,配成質(zhì)量濃度為0.2g·L-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,再以流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為20.0mg·L-1的內(nèi)標(biāo)液,備用。1.3流動(dòng)相、河流動(dòng)力學(xué)色譜柱為KromasilC18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為乙腈-0.02mol·L-1KH2PO4(32∶68,V/V;磷酸調(diào)pH2.40);流速1mL·min-1;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)272nm;定量環(huán)為50μL。1.4甲基叔丁基醚法取1mL血漿置于10mL具塞離心試管中,加入20.0mg·L-1坎地沙坦內(nèi)標(biāo)溶液25μL,混勻后加入1mol·L-1的HCl100μL酸化,旋渦混勻30s,精密加入甲基叔丁基醚5mL,旋渦混勻5min后于4000r·min-1離心10min。轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于另一離心管中氮?dú)獯蹈?殘留物用200μL流動(dòng)相渦混溶解,13000r·min-1離心10min,取50μL上清液進(jìn)樣作HPLC分析。2結(jié)果2.1色譜結(jié)果分析在上述血漿樣品處理方法和色譜條件下,空白血漿與空白血漿加氫氯噻嗪、奧美沙坦和內(nèi)標(biāo)坎地沙坦的色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)在本實(shí)驗(yàn)條件下,藥物氫氯噻嗪、奧美沙坦與內(nèi)標(biāo)色譜峰能完全分離,峰形對(duì)稱,沒(méi)有內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾。氫氯噻嗪、奧美沙坦與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為5.6、11.4和10.1min。2.2高效液相色譜分析取空白血漿900μL,分別加入氫氯噻嗪、奧美沙坦系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各50μL,配制成相當(dāng)于氫氯噻嗪血漿濃度0.005、0.01、0.02,0.04、0.08、0.16、0.32、0.48、0.64mg·L-1,奧美沙坦血漿濃度0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0mg·L-1的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品,再分別加內(nèi)標(biāo)溶液25μL。按“1.4”項(xiàng)下依法操作,進(jìn)行高效液相色譜分析,測(cè)定樣品及內(nèi)標(biāo)的峰面積。以藥物濃度為橫坐標(biāo),藥物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算(權(quán)重系數(shù)為1/ρ),得奧美沙坦回歸方程為y=0.9034ρ-0.0052(r=0.9988),線性范圍為0.01～4.0mg·L-1;氫氯噻嗪回歸方程為y=5.617ρ-0.0121(r=0.9991),線性范圍為0.005～0.64mg·L-1。奧美沙坦與氫氯噻嗪定量限分別為0.01mg·L-1與0.005mg·L-1,RSD分別為7.38%與9.25%。2.3方法的精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限配制分別含氫氯噻嗪質(zhì)量濃度為0.01、0.16、0.48mg·L-1,奧美沙坦質(zhì)量濃度為0.05、1.0、3.6mg·L-1的血漿樣品,按“1.4”項(xiàng)下依法操作,測(cè)定氫氯噻嗪、奧美沙坦和內(nèi)標(biāo)的峰面積,每一濃度進(jìn)行5樣本分析,連續(xù)測(cè)定5d,分別計(jì)算氫氯噻嗪與奧美沙坦日內(nèi)與日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。2.4提取回收率與所需量峰面積配制分別含氫氯噻嗪質(zhì)量濃度為0.01、0.16、0.48mg·L-1,奧美沙坦質(zhì)量濃度為0.05、1.0、3.6mg·L-1的血漿樣品,按“1.4”項(xiàng)下依法操作,測(cè)定氫氯噻嗪、奧美沙坦和內(nèi)標(biāo)的峰面積。分別采用相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算氫氯噻嗪與奧美沙坦檢出量,并與加入量進(jìn)行對(duì)比,計(jì)算相對(duì)回收率;同法配制并處理上述3種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各5份,另取同濃度未經(jīng)處理的氫氯噻嗪和奧美沙坦溶液50μL進(jìn)樣檢測(cè),將各組分兩組峰面積進(jìn)行比較,計(jì)算提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。2.5血漿樣品穩(wěn)定性考察了處理后的氫氯噻嗪、奧美沙坦血漿樣品室溫放置24h的穩(wěn)定性,血漿樣品經(jīng)歷3次凍融循環(huán)的穩(wěn)定性以及血漿樣品-20℃冷凍放置60d的穩(wěn)定性。結(jié)果(表3)表明氫氯噻嗪、奧美沙坦在血漿中比較穩(wěn)定。2.6分組和給藥及血漿10名健康男性受試者,年齡(24.7±2.6)歲,身高(173.2±7.7)cm,體質(zhì)量(65.3±7.4)kg。試驗(yàn)前經(jīng)病史詢問(wèn)、體檢、胸透、ECG、血及尿常規(guī)、血生化檢查,各項(xiàng)指標(biāo)均正常,受試者無(wú)藥物過(guò)敏史和藥物依賴史,無(wú)精神病史及其他慢性病史。所有受試者服藥前禁食12h,翌晨空腹服用奧美沙坦氫氯噻嗪片2片,用溫水200mL送服,服藥后2h允許飲水,4h后統(tǒng)一進(jìn)餐。給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、9、12、24、48h分別取靜脈血5mL,置肝素化試管中,3000r·min-1離心10min得血漿。按“1.4”項(xiàng)下依法操作,進(jìn)行HPLC分析,測(cè)定樣品及內(nèi)標(biāo)的峰面積,根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度,平均藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明,本方法適用于該藥的人體藥動(dòng)學(xué)研究。3復(fù)配制劑的應(yīng)用目前,國(guó)內(nèi)外測(cè)定血漿中氫氯噻嗪與奧美沙坦?jié)舛鹊姆椒ㄖ饕蠬PLC紫外與熒光法、LC-MS法以及LC-MS/MS法。于洋等報(bào)道LC-MS測(cè)定人血漿中奧美沙坦方法的定量限為1μg·L-1,而陳仕恒等同樣采用LC-MS法,其報(bào)道的定量限為25μg·L-1。由于醫(yī)院受實(shí)驗(yàn)設(shè)備及研究經(jīng)費(fèi)等因素的限制,使靈敏度更高的LC-MS法與LC-MS/MS法難以普及。我們建立了同時(shí)測(cè)定血漿中2組分血藥濃度的方法,靈敏度高,重現(xiàn)性好,專一性強(qiáng),完全滿足臨床血藥濃度測(cè)定和藥動(dòng)學(xué)研究的要求。較分別采用HPLC紫外與熒光法測(cè)定血漿中氫氯噻嗪與奧美沙坦?jié)舛鹊姆椒?本法樣品處理更加簡(jiǎn)便、快捷,可同時(shí)測(cè)定受試者或患者服用復(fù)方制劑后血藥濃度。本試驗(yàn)建立的人血漿中氫氯噻嗪與奧美沙坦的HPLC測(cè)定方法,其特異性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度及樣品穩(wěn)定性等均符合生物樣本測(cè)定的要求。在血漿樣品處理方法上,首先考察蛋白沉淀法,分別比較甲