藕節(jié)多糖實驗方案

藕節(jié)多糖提取與抗氧化性一?藕節(jié)多糖的提?。号汗?jié)洗凈，切去雜質(zhì)部分，烘干，稱量記錄數(shù)據(jù)。于去離子水中熬煮，約一個小時，取汁，記錄汁液的毫升數(shù)。汁液于蒸發(fā)濃縮器中蒸發(fā)，大約蒸至原體積的四分之一時停止。記錄所得的濃縮汁液。用3倍的95%的無水乙醇浸沒濃縮液，醇提一天。醇提后冷凍離心，取底料，用95%的無水乙醇多次洗滌，冷凍干燥，稱量記錄數(shù)據(jù)。二.標準曲線的制作：1.儀器：電熱恒溫水浴鍋，分光光度計，電子天平，容量瓶，刻度吸管2試劑：（1） 葡萄糖標準液：100pg/ml（2） 濃硫酸（3）蒽酮試劑：0.2g蒽酮溶于100ml濃H2SO4中。當日配制使用操作步驟 241.葡萄糖標準曲線的制作取7支大試管，按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液：管號1234567葡萄糖標準液（ml）00.10.20.30.40.60.8蒸餾水（ml）10.90.80.70.60.40.2葡萄糖含量（pg）0102030406080在每支試管中立即加入蒽酮試劑4.0m1，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準確煮沸10min取出，用冰浴冷卻至室溫，在620nm波長下以第一管為空白，迅速測其余各管吸光值。以標準葡萄糖含量（pg）為橫坐標，以吸光值為縱坐標，作出標準曲線。結(jié)果處理CXV甘XD樣品含糖量（%）= 旦 X--109-WXVX106其中：C——在標準曲線上查出的糖含測量（pg），V總——提取液總體積（ml），V測——測定時取用體積（ml），D—-稀釋倍數(shù)，W 樣品重量（g），106——樣品重量單位由g換算成pg的倍數(shù)藕節(jié)多糖含量的測定藕節(jié)多糖配置成100ug/ml溶液。去0.5ml于試管中，加0.5ml的蒸餾水。立即加入蒽酮試劑4.0ml,迅速浸于冰水浴中冷卻。后浸于沸水浴中，管口加蓋，煮10mins,再冷卻全室溫后，于620nm下比色。抗氧化性的測定：（清除?OH能力，清除02-?能力，清除DPPH?能力金屬鰲合力的測定）1.清除02-?能力：鄰苯三酚自氧化法是測定清除02-?活性的常用方法。鄰苯三酚在pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液中自氧化可產(chǎn)生0-?和有色中間產(chǎn)物。已知有色中間產(chǎn)物在紫2外區(qū)有吸收，經(jīng)波長掃描，其在320nm處有最大吸收，故可用紫外分光光度儀來定量測定天然抗氧化劑在此體系中對超氧陰離子自由基的清除作用。將待測液配置成濃度梯度為10、20、40、80、160Mg/mL的溶液，以蒸餾水作空白參比，在320nm處測定吸光值。?。ㄈris6.0570g，濃鹽酸（38%，12N）0.4564mL，定容至1L）0.05mol/LpH=8.2的Tris-HCl緩沖液（PH需要很準確，不然結(jié)果變化很大）4.5mL于各試管中，置于25°C水浴鍋中預(yù)熱20min，分別加入不同濃度的待測液1mL和0.2mmol/L的鄰苯三酚溶液0.5mL，混勻后于25C水浴中反應(yīng)5min，再加入1.0mL8mol/LHCl終止反應(yīng)，在320nm處測定吸光度A1⑻。空白對照以同體積的蒸餾水代替樣品提取液，吸光度記為A。；用同體積的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，測得的吸光度記為％。以Vc和BHT作陽性對照，比較待測液的抗氧化能力。每組測定三次，取平均值。根據(jù)公式計算清除率K：K=[A0-（A1-A2）]/A0X1OO%式中：氣為不加樣品的吸光度，％為加樣品的吸光度，A2為樣品在體系中的吸光度濃度0.010.020.040.080.16A10.5920.6200.6340.6700.685A10.6320.6200.6550.6720.684A10.6340.6300.6450.6810.676平均數(shù)0.6190.6230.6450.6740.682A2平0.04170.04070.04400.0500.058A00.6650.6730.664平均0.667(2)對清除?OH能力的測定參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型w。]，利用H2O2與二價鐵離子混合后產(chǎn)生?OH，即：H2O2+Fe2+f?OH+H2O+Fe3+。鄰二氮菲在pH為2-9時，會與Fe2+形成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物，且這種絡(luò)合物在536nm波長處有最大的吸收峰。羥自由基具有很強的氧化性，會將一部分Fe2+氧化成Fe3+，使得橙紅色絡(luò)合物減少。若在此反應(yīng)體系中加入抗氧化劑，讓它與體系中自由基和氧化劑反應(yīng)，使得Fe2+的減少受到抑制，即使得橙紅色絡(luò)合物的減少受到抑制。利用紫外分光光度計在536nm處測量橙紅色絡(luò)合物吸光度的變化，便能測定被測物對?OH清除作用。將待測液配置成5。、15。、25。、35。、450pg/mL的濃度梯度，以(0.75mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS))pH=7.4的PBS溶液()作空白參比，在536nm波長下測定吸光度。分別精確吸取5mmol/L鄰二氮菲溶液(以水將50mmo1/L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋至5mmo1/L)0.5mL置于各個潔凈的10mL刻度試管中，再依次分別加入pH=7.4的PBS溶液2mL，混勻；加入7.5mmol/L的FeSO4溶液(使用時最好現(xiàn)用現(xiàn)配)1mL，混勻；加入0.2%過氧化氫溶液1mL(0.5m1)，加水定容至刻度，搖勻，37°C恒溫水浴下反應(yīng)1h(50min)°(取出時應(yīng)立即將試管放入冰水浴中，讓37。。反應(yīng)立刻終止，然后再拿去比色。)在536nm波長下測定吸光度A1。同上法，但分別多加入1mL不同濃度提取液，蒸餾水定容置刻度，測定吸光度A2；不加過氧化氫溶液和提取液，蒸餾水定容置刻度，測定吸光度A。。以Vc和BHT作陽性對照，比較待測液的抗氧化能力。每組測定三次，取平均值。根據(jù)公式計算清除率K：K=[(A2A1)/(A0A1)]X100%式中：A。為未損傷管的吸光度，％為損傷管的吸光度，％為加待測液的吸光度3.金屬鰲合力的測定參考Dinis的方法，并作適當修改。將待測液配置成5。、15。、25。、35。、450pg/mL的濃度梯度。每管分別加入待測樣品液1mL，3.7mL甲醇和2mmol/L的氯化亞鐵。.1mL溶液放置10min。最后加入5mmol/Lferrozine試劑。.2mL。冷卻全室溫1。min，在562nm處波長下測吸光值。每組測定三次，記錄數(shù)據(jù)，取平均值。吸光值越低表明螯合能力越強。陽性對照檸檬酸、EDTA。A空是加等量蒸餾水，對照是加等量檸檬酸、EDTA。螯合力（％）=A空-（A樣-A對）/A空（4）對清除DPPH?能力的測定[11-12]DPPH?是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，它的穩(wěn)定性主要來自共振穩(wěn)定作用的3個苯環(huán)的空間障礙，使夾在中間的氮原子上不成對的電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對作用。DPPH自由基乙醇溶液呈紫色，最大吸收波長為517nm。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析。體系內(nèi)DPPH?的濃度與其吸光度呈正比，吸光度越低，DPPH?的濃度就越低，即物質(zhì)對DPPH?的清除率越高，該物質(zhì)的抗氧化能力越強。準確稱取20mgDPPH用無水乙醇溶解后用500mL容量瓶定容，最終將其置于棕色試劑瓶，避光保存。此時DPPH?的濃度為0.04mg/mL。將待測液配置成濃度梯度為10、20、40、80、160Mg/mL的溶液，以70%乙醇作為空白參比，在517nm處測定吸光度。分別取2!^不同稀釋濃度的待測液于各試管中，分別加入2mLDPPH?溶液搖勻、靜置；30min后倒入光徑為1cm的比色皿中，以70%乙醇作為空白參比，在517nm處測定其吸光度Ai。同理，測定2mL不同濃度待測液與2mL70%乙醇混合液的吸光度Aj，2mLDPPH?溶液與2mL70%乙醇混合液的吸光度Ac。以Vc和BHT為陽性對照，比較待測液的抗氧化能力。每組測定三次，記錄數(shù)據(jù)，取平均值。各待測液對DPPH?的清除率K的計算公式⑸：K=[1-（Ai-Aj）/Ac]X100%式中：Ac：未加提取液的DPPH?溶液的吸光度；Ai：加入提取液后的DPPH?溶液的吸光度；Aj提取液與提取劑（乙醇）混合后的吸光