第三章生物制品的制備詳解

第三章生物制品的制備詳解第一頁(yè)，共44頁(yè)。一、生物制品原料的選擇、預(yù)處理與保存方法

（1）原料選擇原料的選擇原則：

①有效成分含量高，新鮮；②原料來(lái)源豐富，產(chǎn)地較近；③原料中雜質(zhì)含量少；④原料成本低等。

第一節(jié)一般生物制品的制備方法第一頁(yè)第二頁(yè)，共44頁(yè)。

①植物原料生長(zhǎng)的季節(jié)性；②微生物原料的對(duì)數(shù)期；③動(dòng)物原料的年齡與性別。原料的選擇注意事項(xiàng)：第二頁(yè)第三頁(yè)，共44頁(yè)。①動(dòng)物原料：采集后要立即處理，去除結(jié)締組織、脂肪組織等，并迅速冷凍貯存。②植物原料：要擇時(shí)采集并就地去除不用的部分，保鮮處理；③微生物原料：要及時(shí)將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分開(kāi)，進(jìn)行保鮮處理。

（2）原料的預(yù)處理：第三頁(yè)第四頁(yè)，共44頁(yè)。①冷凍法。該方法適用于所有生物原料。常用-40℃速凍。②有機(jī)溶劑脫水法。常用的有機(jī)溶劑是丙酮。該法適用于原料少而價(jià)值高、有機(jī)溶劑對(duì)活性物質(zhì)沒(méi)有破壞作用的原料，如腦垂體等。③防腐劑保鮮。常用乙醇、苯酚等。該法適用于液體原料，如發(fā)酵液、提取液等。

原料的保存方法：第四頁(yè)第五頁(yè)，共44頁(yè)。生物組織與細(xì)胞的破碎：生物制品大部分存在于生物組織或細(xì)胞中，要提高提取率，破碎過(guò)程是非常重要的。二、生物制品的提取

第五頁(yè)第六頁(yè)，共44頁(yè)。細(xì)胞破碎定義：細(xì)胞破碎是指選用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法來(lái)破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜目的：破壞細(xì)胞的外殼，使細(xì)胞內(nèi)含物有效地釋放出來(lái)，獲得有效的提取。細(xì)胞破碎是生物大分子初級(jí)分離純化的第一步，也是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，它直接影響了產(chǎn)物的加收率及純度第六頁(yè)第七頁(yè)，共44頁(yè)。動(dòng)物細(xì)胞:多分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)液植物細(xì)胞:多為胞內(nèi)產(chǎn)物微生物（細(xì)菌/真菌）:胞內(nèi)、胞外

對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物需要進(jìn)行細(xì)胞破碎。

不同類型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類型：第七頁(yè)第八頁(yè)，共44頁(yè)。胞外：大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中。胞內(nèi)：有些目標(biāo)產(chǎn)物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類物質(zhì)和一些抗生素包含在生物體中。第八頁(yè)第九頁(yè)，共44頁(yè)。細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法機(jī)械破碎法物理破碎法化學(xué)破碎法酶學(xué)破碎法第九頁(yè)第十頁(yè)，共44頁(yè)。一、機(jī)械破碎方法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力的作用，使細(xì)胞破碎的方法稱為機(jī)械破碎法。常用的儀器高速組織搗碎機(jī)勻漿器研磨器第十頁(yè)第十一頁(yè)，共44頁(yè)。二、物理破碎方法通過(guò)各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法，統(tǒng)稱為物理破碎方法。物理破碎方法多用于微生物細(xì)胞的破碎。第十一頁(yè)第十二頁(yè)，共44頁(yè)。物理破碎法的分類物理破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法第十二頁(yè)第十三頁(yè)，共44頁(yè)。三、化學(xué)破碎方法化學(xué)破碎方法：通過(guò)化學(xué)試劑的作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞，使細(xì)胞膜的透過(guò)性改變。常用的化學(xué)試劑可分為有機(jī)溶劑和表面活性劑兩大類。十二烷基硫酸鈉：SDS第十三頁(yè)第十四頁(yè)，共44頁(yè)。四、酶學(xué)破碎方法酶學(xué)破碎方法：利用溶解細(xì)胞壁的酶(外加的或細(xì)胞本身存在的酶)處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓、沖擊等方法破壞細(xì)胞膜分為：外加酶制劑和自溶法。第十四頁(yè)第十五頁(yè)，共44頁(yè)。自溶作用

自溶作用是利用生物體自身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過(guò)程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)下去。自溶作用：改變其生長(zhǎng)環(huán)境（溫度、ｐＨ、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。缺點(diǎn)：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。第十五頁(yè)第十六頁(yè)，共44頁(yè)。（2）提取（extraction）

生物組織與細(xì)胞破碎后要立即進(jìn)行提取。提取時(shí)，首先要根據(jù)活性物質(zhì)的性質(zhì)，

①選擇提取試劑。提取試劑主要有：水、緩沖溶液、鹽溶液、乙醇、其他有機(jī)溶劑（如氯仿、丙酮等）。

②考慮提取溶劑的用量及提取次數(shù)、提取時(shí)間。

③注意提取的溫度、pH、變性劑等因素。第十六頁(yè)第十七頁(yè)，共44頁(yè)。

包括蛋白質(zhì)、多肽和酶類等藥物。分離純化方法有：1.沉淀法：蛋白質(zhì)、酶的初步純化往往用沉淀法。原理是使蛋白質(zhì)膠體顆粒破壞，從而沉淀蛋白質(zhì)。常用的有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、選擇性沉淀法等。2.超濾法和透析法、凝膠層析法、超速離心法等：按分子大小分離的方法。第二節(jié)各類生物制品的分離純化方法一、蛋白質(zhì)類制品的分離純化方法第十七頁(yè)第十八頁(yè)，共44頁(yè)。3.離子交換層析、電泳法、等電點(diǎn)聚焦法等是按分子所帶電荷進(jìn)行分離的方法，氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶均具有等電點(diǎn)，在離開(kāi)等電點(diǎn)的pH時(shí)便會(huì)帶正或負(fù)電荷。4.親和層析法大部分生物活性物質(zhì)都有其作用的靶物質(zhì)，如酶與底物（或抑制劑）、抗原與抗體、激素與受體等，它們之間有特異的親合作用，利用該性質(zhì)設(shè)計(jì)的特異層析分離技術(shù)稱為親和層析。親和層析分離專一性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，是當(dāng)前應(yīng)用很廣泛的分離方法之一。第十八頁(yè)第十九頁(yè)，共44頁(yè)。核酸類藥物生產(chǎn)方法主要有提取法和發(fā)酵法。提取法生產(chǎn)DNA和RNA，先提取核酸和蛋白質(zhì)復(fù)合物，再解離核酸與蛋白質(zhì)，然后分離RNA與DNA。發(fā)酵法主要用于生產(chǎn)單核苷酸。二、核酸類制品的分離純化方法

第十九頁(yè)第二十頁(yè)，共44頁(yè)。基因工程產(chǎn)物的特點(diǎn)：產(chǎn)物大多數(shù)處于細(xì)胞內(nèi)，需進(jìn)行細(xì)胞破碎產(chǎn)物濃度較低，雜質(zhì)多，提純困難產(chǎn)物多是大分子蛋白質(zhì)，通常不穩(wěn)定，易失活第三節(jié)基因工程制品的分離純化方法P79NP98第二十頁(yè)第二十一頁(yè)，共44頁(yè)。1.含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)①菌種類型及其代謝特性。②原材料和培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量；③生產(chǎn)工藝和條件。④初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。目的產(chǎn)物的表達(dá)特性。目的產(chǎn)物本身的分子特性。目的產(chǎn)物的用途和需求量。一、影響分離純化工藝設(shè)計(jì)的主要因素（P79，NP98）第二十一頁(yè)第二十二頁(yè)，共44頁(yè)。分離純化的基本過(guò)程分離純化是極其重要的一環(huán)，這是由于工程菌經(jīng)過(guò)大規(guī)模培養(yǎng)后，產(chǎn)生的有效成分含量很低，雜質(zhì)含量卻很高；另外由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，對(duì)產(chǎn)品的純度要求也高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。分離純化要比傳統(tǒng)產(chǎn)品困難得多。第二十二頁(yè)第二十三頁(yè)，共44頁(yè)。分離純化一般不應(yīng)超過(guò)4～5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。第二十三頁(yè)第二十四頁(yè)，共44頁(yè)。發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化制劑

產(chǎn)品一般制品分離純化的一般流程第二十四頁(yè)第二十五頁(yè)，共44頁(yè)。1、根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇分泌型表達(dá)產(chǎn)物：發(fā)酵液的體積很大、但目標(biāo)產(chǎn)物濃度較低，必須在純化前進(jìn)行濃縮，可用沉淀和超濾的方法濃縮。產(chǎn)物在周質(zhì)表達(dá)：為了獲得周質(zhì)蛋白，E.coli經(jīng)低濃度溶菌酶處理后，可采用滲透壓裂解的方法來(lái)獲得，能夠回收到高質(zhì)量的產(chǎn)物?？扇苄员磉_(dá)產(chǎn)物：破菌后的細(xì)胞上清，首選親和分離方法。如果沒(méi)有可以利用的單克隆抗體或相對(duì)特異性的親和配基，一般先用離子交換色譜，處于極端等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)用離子交換分離能去掉大部分的雜質(zhì)。二、選擇分離純化方法的依據(jù)P80，ＮＰ99第二十五頁(yè)第二十六頁(yè)，共44頁(yè)。應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元來(lái)組成一套分離純化工藝，盡早采用高效的分離手段，先將含量最多的雜質(zhì)分離去除，將費(fèi)用最高、最費(fèi)時(shí)的分離單元放在最后階段。2、根據(jù)分離單元之間的銜接選擇第二十六頁(yè)第二十七頁(yè)，共44頁(yè)。分離單元之間的鏈接：Ｐ80，ＮＰ100①先選用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀、超濾和吸附等），以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要的雜質(zhì)（包括非蛋白類雜質(zhì)）；②隨后采用高分辨率的操作單元（如具有高選擇性的離子交換色譜和親和色譜）；③凝膠排阻色譜這類分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元放在最后。第二十七頁(yè)第二十八頁(yè)，共44頁(yè)。分離純化工藝應(yīng)遵循以下原則：（1）工藝條件應(yīng)溫和，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性：不受或少受發(fā)酵工藝、條件及原材料來(lái)源的影響，在任何環(huán)境下使用都應(yīng)具有重復(fù)性，明確需嚴(yán)格控制的步驟和技術(shù)（2）盡可能減少組成工藝的步驟：步驟越多，產(chǎn)品的后處理收率越低，但必須保證產(chǎn)品的質(zhì)量3、根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇第二十八頁(yè)第二十九頁(yè)，共44頁(yè)。（3）組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)（4）在工藝過(guò)程中要盡可能少用試劑，以免增加步驟，或干擾產(chǎn)品質(zhì)量（5）時(shí)間要盡可能短，因穩(wěn)定性差的產(chǎn)物隨工藝時(shí)間增加，生物活性收率會(huì)降低，產(chǎn)品質(zhì)量會(huì)下降（6）必須高效、收率高、易操作，對(duì)設(shè)備條件要求低，能耗低（7）具有較高的安全性：藥品必須保證安全、無(wú)菌、無(wú)熱原、無(wú)污染第二十九頁(yè)第三十頁(yè)，共44頁(yè)。三、各種不同表達(dá)形式的產(chǎn)物采用的分離純化方法（P81，ＮＰ101）（一）細(xì)胞內(nèi)不溶性產(chǎn)物——包含體（或包涵體）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組小分子目的蛋白，以不溶性形式產(chǎn)生并聚集形成蛋白質(zhì)聚合物——包含體以包含體形式存在的蛋白分子不具有正確的天然三維結(jié)構(gòu)，表達(dá)蛋白不具有生物活性，因此在純化過(guò)程中必須溶解包含體并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行復(fù)性。步驟：細(xì)胞收集與破碎、包含體的分離、洗滌與溶解、變性蛋白質(zhì)的純化、重組蛋白質(zhì)的復(fù)性、天然蛋白質(zhì)的分離第三十頁(yè)第三十一頁(yè)，共44頁(yè)。（二）分泌型的表達(dá)產(chǎn)物（P83，NP103）分泌型的表達(dá)產(chǎn)物通常體積較大、濃度較低，必須在純化以前進(jìn)行濃縮濃縮方法包括：沉淀、超濾第三十一頁(yè)第三十二頁(yè)，共44頁(yè)。（三）細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)產(chǎn)物可獲得高純度、高活性的目的蛋白質(zhì)第三十二頁(yè)第三十三頁(yè)，共44頁(yè)。（四）細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)蛋白周質(zhì)表達(dá)的蛋白是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌型表達(dá)之間的一種表達(dá)形式，它可以避開(kāi)細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質(zhì)，在一定程度上有利于蛋白產(chǎn)物的分離純化。為了獲取周質(zhì)蛋白，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)低濃度溶菌酶處理后，一般用滲透壓裂解法獲取。由于周質(zhì)中的蛋白僅有為數(shù)不多的幾種分泌蛋白，同時(shí)又無(wú)蛋白水解酶的污染，因此通常能夠回收到高質(zhì)量的蛋白產(chǎn)物。第三十三頁(yè)第三十四頁(yè)，共44頁(yè)。第三十四頁(yè)第三十五頁(yè)，共44頁(yè)。分離純化主要依賴色譜分離方法。該法是設(shè)備簡(jiǎn)單，便于自動(dòng)化控制和分離過(guò)程中無(wú)發(fā)熱等有害效應(yīng)。色譜技術(shù)分為①離子交換色譜、②疏水色譜、③反相色譜、④親和色譜、⑤凝膠過(guò)濾色譜、⑥高壓液相色譜等。選擇純化方法尤其重要的根據(jù)是表面性質(zhì)的差異。四、色譜法p84第三十五頁(yè)第三十六頁(yè)，共44頁(yè)。一、原材料的質(zhì)量檢測(cè)與控制原材料的質(zhì)量控制是要確保編碼生物制品的DNA序列的正確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。第四節(jié)生物制品的質(zhì)量檢測(cè)與控制

P90，ＮＰ111第三十六頁(yè)第三十七頁(yè)，共44頁(yè)。

在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過(guò)程中，要求工程菌所含的重組質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無(wú)突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。二、培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制第三十七頁(yè)第三十八頁(yè)，共44頁(yè)。產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱原質(zhì)都控制在規(guī)定限度以下。三、純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制

第三十八頁(yè)第三十九頁(yè)，共44頁(yè)。1、產(chǎn)品的鑒別2、純度分析（1）目的蛋白質(zhì)含量測(cè)定：SDS、等電點(diǎn)聚焦、HPLC、毛細(xì)管電泳等。（2）雜質(zhì)：①蛋白類雜質(zhì)②非蛋白類雜質(zhì)。3、生物活性測(cè)定4、安全性評(píng)價(jià)5.穩(wěn)定性檢測(cè)6、產(chǎn)品一致性的保證四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制P93,NP114第三十九頁(yè)第四十頁(yè)，共44頁(yè)。重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品常用的鑒定方法①電泳方法：SDS，等電點(diǎn)聚焦，免疫電泳②免疫學(xué)分析方法：放免法，放射性免疫擴(kuò)散法酶聯(lián)免疫吸附法，免疫印漬③受體結(jié)合試驗(yàn)④各種高效液相分析法⑤肽圖分析法⑥EdmanN末端序列分析法⑦圓二色譜⑧核磁共振第四十頁(yè)第四十一頁(yè)，共44頁(yè)。1、液態(tài)保存（1）低溫保存：液態(tài)蛋白質(zhì)樣品在-10～-20℃以下