蜂蜜產(chǎn)地來源及摻偽判別方法研究進展

蜂蜜產(chǎn)地來源及摻偽判別方法研究進展

0蜂蜜摻假檢測技術的應用背景根據(jù)現(xiàn)代研究，蜂蜜含有180多種成分，葡萄糖和糖果是主要成分，其次是水、葡萄糖、礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)和氨基酸。中醫(yī)的臨床和實踐表明，蜜蜂具有改善脾胃功能、促進消化、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、提高身體素質(zhì)、促進兒童生長發(fā)育等功效。同時，這項研究還表明，蜜蜂對治療燒傷和傷口、促進潰瘍愈合、傷口愈合和心血管疾病的輔助治療方面具有良好的療效。隨著人們生活水平的提高，人們對蜂蜜及其產(chǎn)品的特性、食用和藥用價值有了深刻的理解。蜂蜜的需求增加，對質(zhì)量的要求也在增加。但是由于利益的驅動,摻假制售假蜂蜜的現(xiàn)象時有發(fā)生,其中常見的摻假方法主要是摻入蔗糖、果糖、葡萄糖、葡萄糖糖漿等.有些廠家甚至以葡萄糖、葡萄糖糖漿、果糖糖漿、蜂蜜香精等替代原料制造假蜂蜜,以天然蜂蜜的形式投放市場,獲取暴利,這不僅損害消費者的利益、造成了蜂蜜市場的混亂,同時也會影響一個國家蜂蜜的進出口貿(mào)易.國際食品法典委員會、歐盟及其他國家都制定了蜂蜜品質(zhì)標準以及蜂蜜的真實性推薦鑒別方法.然而,近年來由于蜂蜜造假向規(guī)?；I(yè)化發(fā)展,造出的假蜂蜜產(chǎn)品感官指標和部分理化指標都與天然蜂蜜產(chǎn)品極為相似,假蜂蜜的市場占有率越來越大,因此,建立準確、快速、有效的蜂蜜摻假檢測方法是食品安全和蜂蜜生產(chǎn)研究中的一個熱點.筆者綜述了國外研究工作者近年來在識別蜂蜜產(chǎn)地及植物來源、辨別蜂蜜真?zhèn)畏矫嫠_展的一些研究工作,主要包括蜂蜜理化指標分析、色譜及其聯(lián)用技術、光譜方法、同位素比率分析法、電子鼻以及差熱分析、生物免疫技術等,下面分別予以簡單介紹.1利用蜜蜂的化學參數(shù)進行蜜蜂分類蜂蜜的理化指標主要包括密度、黏度、流變性、水分、淀粉酶值、羥甲基糠醛(HMF)和氨基酸、金屬礦物質(zhì)元素、pH值、電導率等.通過測定這些參數(shù),可對蜂蜜進行質(zhì)量控制或摻假的初步判斷.傳統(tǒng)的理化檢驗單純利用其中個別指標進行蜂蜜的真?zhèn)舞b別,存在相當大的局限性.S.Popek利用蜂蜜的3個主要物理參數(shù)(總灰分、總酸度和動態(tài)黏度)對73種蜂蜜進行分類辨別分析,正確分類率達到98.67%.S.Serrano等利用水分、HMF、淀粉糖化酵素、pH值、內(nèi)酯酸、電導率、轉化酶、葡萄糖、果糖、蔗糖、脯氨酸、葡萄糖活化酶、活性水及不溶固形物等化學參數(shù)對安達盧西亞的兩種不同植物來源的蜂蜜進行了分類分析,數(shù)據(jù)處理采用方差分析,挑出了對分類影響最顯著(方差百分比達78.95%)的6種化學參數(shù)(酸、水分、轉化酶、總糖度、電導率和固形物),用主成分分析和逐步辨別分析(SDA)建立數(shù)學模型進行蜂蜜分類,準確分類率達到96.6%.M.V.Baroni等利用蜂蜜的化學參數(shù)和微量礦物質(zhì)對阿根廷南北不同產(chǎn)地的蜂蜜進行了辨別分析,葡萄糖、游離酸、pH、游離氨基酸、鈣和鋅離子被發(fā)現(xiàn)是影響分類的22個參數(shù)中最重要的6個參數(shù),這6個參數(shù)被用在逐步回歸和K-最鄰近判別分析中,對不同產(chǎn)地的蜂蜜分類的正確率達到99%,但是,當22個參數(shù)全用時正確分類率只有83%.R.Fernandez-Torres等利用等離子光譜測定蜂蜜中的11種元素(Zn、P、B、Mn、Mg、Cu、Ca、Ba、Sr、Na和K),對40個不同地方包含了4種不同植物來源的蜂蜜進行了分類研究,將獲得的數(shù)據(jù)分別用有監(jiān)督和無監(jiān)督模式識別方法進行辨別分析,發(fā)現(xiàn)不同花種來源的蜂蜜辨別難度差異較大,桔子花和迷迭香花來源的蜂蜜最難辨別;L.A.Marghitas等利用前面所述的化學物理參數(shù)以及總酚量、總類黃酮量和蜂蜜的抗氧化活性參數(shù)也進行了類似的研究.2蜂蜜品質(zhì)分析色譜方法是蜂蜜品質(zhì)鑒別和摻假鑒別中常用的方法,主要運用包括氣相色譜、液相色譜及其聯(lián)用方法分析蜂蜜中的糖類、類黃酮、多酚、有機酸、揮發(fā)性物質(zhì)、氨基酸以及礦物質(zhì)等,用這些標記物進行蜂蜜品質(zhì)和摻假鑒別分析.2.1蜂蜜中的標志化合物氣相色譜及其聯(lián)用技術主要檢測蜂蜜中的揮發(fā)性成分,由于不同植物來源的蜂蜜或摻加了不同物質(zhì)的假蜂蜜含有不同揮發(fā)性成分,從而可判定其植物來源、產(chǎn)地或者是否摻假.K.A.Aliferis等運用頂空固相微萃取提取蜂蜜中的揮發(fā)成分,然后直接進行GC-MS分析,將獲取的數(shù)據(jù)分別運用偏最小二乘-辨別分析(PLS-DA)、SIMCA聚類、正交偏最小二乘-逐級聚類(OPLS-HCA)等進行分析,所得結果進行對比發(fā)現(xiàn)OPLS-HCA的誤判率最低,只有1.3%,同時通過MS檢驗可以發(fā)現(xiàn)蜂蜜中的標志性化學物質(zhì);A.I.Ruiz-Matute等用GC和GC-MS對蜂蜜進行摻假研究,發(fā)現(xiàn)被檢測蜂蜜經(jīng)熱處理后,在摻假蜂蜜中能檢測到二果糖酸酐(DFA),而在天然蜂蜜中檢測不到DFA,因此,作者認為DFA可作為標志物鑒別蜂蜜中是否摻入了高果糖玉米糖漿(HFCS)和轉化糖(IS);M.L.Sanz等利用GC-MS通過對蜂蜜中的16種二糖和9種三糖進行定性和定量檢測,鑒別蜂蜜是否用糖漿摻假;K.L.Barry等用氣相色譜和模式識別方法對非洲的蜂蜜做了區(qū)分鑒定,結果顯示,模式識別遺傳算法與人工智能和進化算法相結合可以很好地將歐洲和非洲的蜂蜜進行分離.全二維氣相色譜—飛行時間質(zhì)譜(GC-GC-TOFMS)也已經(jīng)被應用于蜂蜜產(chǎn)地、植物來源摻假的研究中.如I.Stanimirova等和C.Tomas等分別使用頂空固相微萃取(HS-SPME)和GC-GC-TOFMS相結合的方法來分析不同產(chǎn)地和植物來源的蜂蜜的揮發(fā)物;I.Stanimirova等應用LDA法、SIMCA法、DPLS法、SVM法和最近提出的PUK法調(diào)查和研究了蜂蜜的產(chǎn)地來源,并取得了很好的效果;C.Tomas等運用化學計量方法,將人工神經(jīng)網(wǎng)絡同多層感知器相結合(ANN-MLP)進行檢測分析,對來自歐洲一些國家和地區(qū)的374個蜂蜜樣品進行了鑒定分析,都取得了很好的預測結果和準確的類別鑒定結果.2.2蜂蜜品質(zhì)分析蜂蜜中的氨基酸、酚類、類黃酮化合物等經(jīng)常用作鑒別蜂蜜產(chǎn)地和植物來源的標記物.F.A.Tomas-Barberan等用反相C-18柱梯度洗脫分析了不同植物來源的蜂蜜中的類黃酮物質(zhì),發(fā)現(xiàn)類黃酮可以作為鑒別不同植物來源的蜂蜜標記物;C.P.Arquillue等將蜂蜜中的蛋白質(zhì)用酸水解后,采用HPLC測定出16種氨基酸,通過辨別分析可以確定西班牙本地的蜂蜜和其他蜂蜜的差別;M.Pawlowska等應用HPLC測定蜂蜜中脯氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸的總量以及它們的對映體比例來研究不同的蜂蜜差別,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地和不同植物來源的蜂蜜中D-亮氨酸和D-苯丙氨酸存在顯著差別,可以作為標記物對蜂蜜進行品質(zhì)鑒別;E.Jorg等發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蜂蜜中含有甲酯-4-羥基苯甲酸甲酯、香草酸甲酯和丁香酸甲酯,但是含量不同,有些蜂蜜中甚至可能不含其中的任何一種,由此可以作為蜂蜜產(chǎn)地和來源的鑒別指標,如洋槐蜜中就不含丁香酸甲酯,可以和其他蜂蜜區(qū)分開;J.F.Cotte等利用HPLC技術對在油菜蜜和冷杉蜜中摻入糖漿的蜂蜜進行摻假鑒別,結果表明,蜂蜜中摻入糖漿的檢測限可以達到10%~20%.蜂蜜中糖的組成經(jīng)常被用作判定蜂蜜摻假的指標,統(tǒng)計分析顯示糖中HFCS、鈣、水分、灰分含量可以作為真假蜂蜜鑒別的標記物.高效陰離子交換色譜法利用單糖在堿性溶液中以陰離子形式存在,可以在陰離子交換柱上被保留并得到分離,然后利用不同的檢測器對糖類進行檢測從而進行摻假辨別;V.Morales等利用高效陰離子交換色譜對分別摻入了5%、10%和20%的糖漿的蜂蜜進行研究,用脈沖安培檢測,并用活性炭去除單糖和雙糖,只留下低聚糖,分析發(fā)現(xiàn)除普遍的玉米糖漿(CS)和HFCS摻假外,還存在不同程度的異構糖漿蜂蜜摻假(20%和40%).這種方法可以檢測到蜂蜜中最低5%的CS;B.Y.Christophe等通過高效陰離子交換法對蜂蜜中微量和重要的糖進行分離,用脈沖安培檢測,提出了一種新的化學計量方法———COFRAC法,該法可以最大限度地提取色譜分離中的化學信息.所獲得的數(shù)據(jù)分別用PCA-LD和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(ANN)進行模式識別分析,結果顯示對真假蜂蜜的分離準確率分別達到93%和100%.他們還用該法對不同摻假程度(含量從10%到40%)的假蜂蜜和真蜂蜜進行了模式識別研究,結果表明,通過PLS建立的相應線性回歸模型,可以很好地將真假蜂蜜區(qū)別開.3光譜法3.1紅外光譜分析技術紅外光譜技術包括近紅外和中紅外光譜技術,是蜂蜜質(zhì)量控制和摻假鑒別中最常用的分析技術,其原理是利用真蜂蜜和摻假蜂蜜中以糖類為主的化學成分的不同獲得光譜數(shù)據(jù),然后利用模式識別技術對這些數(shù)據(jù)進行辨別分析.其中,S.Sivakesava研究小組和G.Downey研究小組在此方面進行了大量探索研究.由于蜂蜜品種中反映不同種類的特征性成分含量低,以及不同品種蜂蜜之間所含的主要成分如糖及水分差別不大,因此運用紅外光譜進行種類和摻假鑒別必須依賴數(shù)據(jù)處理方法,以提高預測結果的準確度和精確度.在這些研究中,他們主要采用LDA、典型變量分析(CVA)、PCA和PLS等對摻加了葡萄糖、果糖、蔗糖和糖漿的假蜂蜜進行了鑒別分析,都取得了比較滿意的分析結果.此外,G.Downey小組用葡萄糖與果糖按質(zhì)量比配制一定比例的摻假溶液加入到真蜂蜜中,然后在近紅外和中紅外光譜范圍內(nèi)對摻有不同比例葡萄糖和果糖的蜂蜜樣品進行判別分析.得到的光譜數(shù)據(jù)分別用PLS、K-最近鄰法(KNN)和有監(jiān)督聚類方法(SIMCA)進行摻假判別分析,研究發(fā)現(xiàn)摻加假蜂蜜的量越大正確分類的準確率越高,質(zhì)量比為14%的摻假樣品的分類準確率可以達到99%,之后他們又對分別摻有轉化甜菜糖漿、高果玉米糖漿、部分轉化甘蔗糖漿、葡萄糖糖漿和甜菜蔗糖的蜂蜜樣品進行了判別分析,大部分摻假蜂蜜的分類正確率均在90%以上,只有摻加高果玉米糖漿和轉化甜菜糖漿的摻假樣品因判別正確率比較低(分別為75%和71.4%),認為不能與真實蜂蜜區(qū)別開來.由于紅外光譜對微量成分的不敏感和水中氫鍵的影響,以及隨著摻假技術的提高,紅外光譜在分析蜂蜜摻假中的應用需要進一步探索和改進.3.2不同凈化方法對于蜂蜜理化指標的分析可采用前表面熒光光譜法前表面熒光光譜法進行了蜂蜜中含有可以產(chǎn)生熒光的多酚以及氨基酸等,氨基酸主要來源于植物花粉,可以作為蜂蜜產(chǎn)地、植物來源辨別和摻假分析的標記物.R.Kaspar等用前表面熒光光譜法對11種單一花蜜和混合花蜜類型(371種樣品)進行了鑒定分類.光譜數(shù)據(jù)處理采用化學計量學PCA和LDA分析建立數(shù)學模型,分類正確率均大于90%,該研究表明了前表面熒光光譜法對蜂蜜的植物來源鑒定的可能,但是該法需要大量已知蜂蜜產(chǎn)地的蜂蜜熒光數(shù)據(jù)庫才能保證結果的可靠.R.Karoui等用前表面熒光光譜對瑞士生產(chǎn)的蜂蜜樣品按植物來源進行了分類.蜂蜜熒光數(shù)據(jù)來自于7種蜜源植物,即洋槐蜜、薔薇蜜、栗樹蜜、油菜蜜、甘露蜜、高山花蜜和低洼花蜜.研究把通過PCA得到的前10個主成分數(shù)據(jù)匯總為一個矩陣,再進行多變量因子辨別分析,對標準品和驗證樣品的分類準確度分別達到100%和90%.結論表明了所研究的蜂蜜在不同的環(huán)境因素下,各自的理化性能也有所不同.同時還證明前表面熒光光譜法有望適用于蜂蜜的植物來源鑒定.3.3蜂蜜的拉曼光譜定量分析M.M.Paradkar等利用傅立葉變換拉曼光譜,對3類摻入了甘蔗轉化糖漿和甜菜轉化糖漿制成的假蜂蜜進行研究,在200~1600cm-1的光譜范圍內(nèi)測得的拉曼光譜數(shù)據(jù),用化學計量學方法PLS和PCR進行了摻假定量分析,利用LDA和CVA對蜂蜜是否摻假進行判別,判別正確率達到了96%.研究還表明,如果能建立所有植物來源蜂蜜的拉曼光譜數(shù)據(jù),鑒別正確率將會大大提高.3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析A.James等用氫質(zhì)子核磁共振波譜對5個國家的10個不同地區(qū)的蜂蜜進行了產(chǎn)地辨別分析,通過氫質(zhì)子核磁共振波譜獲得蜂蜜的指紋波譜數(shù)據(jù),分別用偏最小二乘結合辨別分析(PLS-LDA)、兩級遺傳算法(Two-stageGP)、偏最小二乘結合遺傳算法(PLS-GP)3種模式識別方法進行數(shù)據(jù)處理,結果顯示3種算法對阿根廷蜂蜜和非阿根廷蜂蜜區(qū)分的準確率分別為75.8%、94.5%和96.2%,該法還討論了數(shù)學建模時對分類影響最大的蜂蜜的化學成分,并第一次發(fā)現(xiàn)了蜂蜜中存在的葫蘆巴堿及其對蜂蜜識別過程的影響.4其他方法4.1蜂蜜摻假及分類方法利用無線網(wǎng)絡檢測結果,和一般工電子鼻是利用氣體傳感器陣列的響應圖案來識別氣味的電子系統(tǒng).電子鼻技術具有響應時間短、檢測速度快、重復性好、不需要復雜的預處理過程,并且能避免人為誤差的特點;WeiZhenbo等對8種不同種類的植物來源的蜂蜜和5個不同產(chǎn)地的阿拉伯蜂蜜進行了分析研究,以確定它們的植物來源和產(chǎn)地.利用電子鼻獲得的數(shù)據(jù)和主成分分析(PCA)、聚類分析(CA)以及ANN相結合,結果顯示ANN對蜂蜜的植物來源和產(chǎn)地的確認正確率可以達到95%,該方法同樣可以用作蜂蜜的摻假識別.J.Lammertyn等利用zNose電子鼻技術對蜂蜜的摻假進行了研究.zNose電子鼻是一種尖端的新型化學分析儀器,它以超速氣相色譜分析(FGC)和聲表面波(SAW)檢測器聯(lián)用為基礎,將氣味的化學色譜轉化成高分辨率的可視化嗅覺圖像(VaporPrint或稱指紋氣味),然后根據(jù)這些嗅覺圖像來識別不同的氣味.通過采用傳感器陣列和模式識別技術對分析對象進行分類.J.Lammertyn等用zNose電子鼻得到真蜂蜜和摻假蜂蜜的VaporPrint,由于真?zhèn)畏涿鄣幕瘜W組成不同,產(chǎn)生的芳香氣味不同,該法將電子鼻取得的數(shù)據(jù)用PCA和典型辨別分析(CDA)相結合,對15到16種真假蜂蜜的分類正確率到達了94%.L.Roland等也用電子鼻結合一個改進的ANN方法對6種不同的蜂蜜進行了分類研究,他們用10種不同的半導體氣體傳感器獲取蜂蜜的氣味數(shù)據(jù),然后用改進的神經(jīng)網(wǎng)絡及標準BP神經(jīng)網(wǎng)絡方法對比進行蜂蜜分類研究,結果顯示改進的神經(jīng)網(wǎng)絡分類正確率達到99.6%,而標準BP神經(jīng)網(wǎng)絡方法分類正確率只有91.3%,說明了不同的數(shù)據(jù)處理方法在蜂蜜分類中的重要性.4.2免疫印跡技術免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting),是根據(jù)抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法.該法將混合抗原樣品在凝膠板上進行單向或雙向電泳分離,然后取固定化基質(zhì)膜與凝膠相貼.在印跡紙的自然吸附力、電場力或其他外力作用下,使凝膠中的單一抗原組分轉移到印跡紙上,并且固相化.最后應用免疫同位素探針或免疫酶探針等,對抗原固定化基質(zhì)膜進行檢測和分析,用于鑒定某種蛋白,也可對蛋白進行定性和半定量分析.J.Sy咬imua等用多克隆技術分析不同產(chǎn)地、植物來源蜂蜜中的蛋白質(zhì),研究了蜂蜜中最豐富的RJ蛋白(55Ka蛋白),發(fā)現(xiàn)RJ蛋白中最常見的Apalbumin-1蛋白可作為蜂蜜產(chǎn)地和摻偽鑒別的標記物,免疫印跡技術取得了滿意的結果,同時研究了RJ蛋白在小鼠中的活性表達.M.V.Baroni等以蜂蜜中的花粉蛋白作為化學標記,用免疫印跡技術測定蜂蜜的植物來源和產(chǎn)地,試驗以向日葵和桉樹兩種植物的花粉蛋白制作抗體,并對來源于這兩種植物的蜂蜜進行識別,結果發(fā)現(xiàn)可以很好地把其他植物來源的蜂蜜和它們分開,該法也可用作蜂蜜真?zhèn)蔚蔫b別,其不足是要選擇好SDS膠濃度,否則目標蛋白得不到較好的分辨,另外還需要注意假陽性情況的出現(xiàn).4.3dsc曲線特性差示掃描量熱法(DSC)是20世紀60年代以后出現(xiàn)的一種熱分析方法,它是在程序控制溫度下,測量輸入到物質(zhì)和參比物的溫度差和溫度的關系的一種技術.DSC能定量地測定各種熱力學參數(shù)(如熱焓、熵和比熱等)和動力學參數(shù),它以樣品吸熱或放熱的速率,即熱流率dH/dt(單位毫焦/秒)為縱坐標,以溫度T或時間t為橫坐標,記錄到的曲線稱DSC曲線.鑒于蜂蜜和糖漿不同的熱力學性質(zhì),它們的差別將會在DSC曲線圖中表現(xiàn)出來,因此可以依此對摻假蜂蜜進行鑒別.DSC具有分辨能力高、靈敏度高、快速、樣品需要量少的優(yōu)點.Cordella等用該法進行蜂蜜品種和摻假鑒別,試驗設計首先用DSC確定純蜂蜜和純糖漿的熱行為;然后再用DSC檢測添加糖漿蜂蜜的曲線,觀察它們彼此的改變,由此來判別蜂蜜產(chǎn)地和真假.研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜和糖漿的玻璃化溫度(Tg)相差大于或等于10℃.由此可用玻璃化溫度區(qū)別蜂蜜和糖漿.同時研究也發(fā)現(xiàn)熱力學參數(shù)熔融熱焓(△H)不能用作蜂蜜品種的檢驗.4.41c-4植物生產(chǎn)中蜂蜜的摻假自然界有3種光合作用的循環(huán)方式.碳同位素檢驗技術的原理就是基于自然界幾乎所有蜜源植物的光合作用都是利用碳-3分子循環(huán)生成碳水化合物(糖類物質(zhì)),即卡爾文循環(huán),另外還有一類主要的循環(huán)即C-4分子循環(huán),稱為哈奇-斯萊克(Hatch-Slack)循環(huán).兩種不同的循環(huán)過程形成的兩種碳水化合物(糖類物質(zhì))的碳同位素比值(13C/12C,用δ13C表示)不同.一般情況下C-3植物的δ13C值在-22‰~-32‰之間;而C-4植物的δ13C值在-8‰~-20‰之間.如蜂蜜中δ13C值大于-23.5‰,一般認為蜂蜜中可能摻入甘蔗、高粱、玉米等制備的C-4植物來源的糖分,但對于摻入的水稻、小麥、大豆等C-3植物淀粉制備的糖類成分就很難區(qū)分開來.研究人員又想到用蜂蜜中的蛋白質(zhì)中的C來鑒別摻假,并將其與蜂蜜的δ13C值差值(Δδ13C)來判斷蜂蜜摻假與否,如果Δδ13C值高于1‰,則認為最小摻假量為7%.在G.J.Padovan的試驗中,研究人員發(fā)現(xiàn)如果摻入1%~10%的蔗糖糖漿,摻假蜂蜜與其蛋白質(zhì)的Δδ13C值都小于1‰,這時會把這些摻假蜂蜜誤判為“合格”的純蜂蜜;當加入20%、