蠟樣芽孢桿菌

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)

蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蠟樣芽胞桿菌的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品和食物中毒樣品中蠟樣芽胞桿菌的檢驗(yàn)。規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB／T4789.2食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定GB／T4789.28—2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑設(shè)備和材料冰箱：0°C?4°C。3.2恒溫培養(yǎng)箱：36°C±1°C。3.3恒溫水浴鍋：46C±lC。3.4顯微鏡：10x?100x。3.5均質(zhì)器或滅菌乳缽。3.6架盤藥物天平：Og?500g，精確至0.59。.7滅菌錐形瓶：500mL。3.8滅菌試管：16mmx160mm。3.9滅菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。3.10滅菌平培養(yǎng)皿：直徑90mm。滅菌刀、剪、鑷子等。培養(yǎng)基和試劑肉浸液肉湯培養(yǎng)基：GB／T4789.282003中4.1。酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基：GB／T4789.28—2003中4.65。動(dòng)力一硝酸鹽培養(yǎng)基：GB／T4789.28—2003中4.72。緩沖葡萄糖蛋白胨水：GB／T4789.28—2003中3.4。血瓊脂培養(yǎng)基：GB／T4789.28--2003中4.6。3％過氧化氫溶液。甲萘胺一乙酸溶液：GB／T4789.28—2003中3.17。對(duì)氨基苯磺酸一乙酸溶液：GB／T4789.28—2003中3.17。革蘭氏染色液：GB／T4789.28—2003中2.2。4.10甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂培養(yǎng)基：GB/T4789.28—2003中4.64。0.5％堿性復(fù)紅染色液：GB／T4789.28—2003中2.8。4.12木糖-明膠培養(yǎng)基：GB/T4789.28—2003中4.66。檢驗(yàn)程序蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)程序見圖1。

6操作步驟6.1菌數(shù)測定以無菌操作將檢樣25g(mL)，用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成10-1?10-5的稀釋液按GB/T4789.2測定。取各稀釋液0.1mL，接種在兩個(gè)選擇性培養(yǎng)基-甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂培養(yǎng)基上，用L形棒涂布于整個(gè)表面，置36°C±1°C培養(yǎng)12h?20h,選取適當(dāng)菌落數(shù)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，蠟樣芽胞桿菌在此培養(yǎng)基上的菌落為粉紅色表示不發(fā)酵甘露醇)周圍有粉紅色的暈(表示產(chǎn)生卵磷脂酶)。計(jì)數(shù)后，從中挑取五個(gè)此種菌落做證實(shí)試驗(yàn)，根據(jù)證實(shí)的蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)計(jì)算出該平板上的菌落數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)，即得每克毫升)樣品中所含蠟樣芽胞桿菌數(shù)。例如：將0.1mLl0-4樣品稀釋液涂布于MYP平板上，其可疑菌落為25個(gè)，取五個(gè)鑒定，證實(shí)四個(gè)菌落為蠟樣芽胞桿菌，則1g(mL)檢樣中所含蠟樣芽胞桿菌數(shù)為：25x4/5x104x10=2x1066.2分離培養(yǎng)取檢樣或稀釋液劃線分離于選擇性培養(yǎng)基(MYP)上，置37C培養(yǎng)12h?20h,挑取可疑的蠟樣芽胞桿菌菌落(見6.1)接種于肉湯和營養(yǎng)瓊脂做成純培養(yǎng)，然后做證實(shí)試驗(yàn)。6.3證實(shí)試驗(yàn)6.3.1形態(tài)觀察本菌為革蘭氏陽性大桿菌，寬度在lym或lym以上，芽胞呈卵圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一端。6.3.2培養(yǎng)特性本菌在肉湯中生長混濁，常微有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化；在普通瓊脂平板上其菌落不

透明、表面粗糙、似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣不整齊。6.3.3生化性狀及生化分型6.3.3.1生化性狀本菌有動(dòng)力；能產(chǎn)生卵磷脂酶和酪蛋白酶；過氧氫酶試驗(yàn)陽性；溶血；不發(fā)酵甘露醇和木糖；常能液化明膠和使硝酸鹽還原；在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。6.3.3.2生化分型根據(jù)蠟樣芽胞桿菌對(duì)檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P反應(yīng)、明膠液化性狀的試驗(yàn)，分成不同型別，見表1。表1蠟樣芽胞桿菌生化分型型別生化試驗(yàn)檸檬酸鹽利用硝酸鹽還原淀粉水解V—P反應(yīng)明膠液化1+++++2++++3++++4+++5++6+++7++++8+++9++10+++11++++12+++13+14++15+++6.3.4與類似菌鑒別本菌與其他類似菌的鑒別見表2。表2蠟樣芽胞桿菌與其他類似菌的鑒別項(xiàng)目巨大芽胞桿菌蠟樣芽胞桿菌蘇云金芽胞桿菌蕈狀芽胞桿菌炭疽芽胞桿菌過氧化氫酶+++++動(dòng)力±±±--硝酸鹽還原-++++酪蛋白分解±+±±±卵黃反應(yīng)-++++葡萄糖利用（厭氧）-++++甘露醇+----木糖±----溶血-++±±已知致病菌特性產(chǎn)生腸毒素對(duì)昆蟲致病的內(nèi)毒素結(jié)晶假根樣生長對(duì)動(dòng)物和人致病注：+90%?100%的菌株陽性；一90%?100%的菌株陰性；土大多數(shù)菌株陽性本菌在生化性狀上與蘇云菌芽胞桿菌極為相似，但后者可籍細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶加以鑒別。其檢查方法如下：取營養(yǎng)瓊脂上純培養(yǎng)物少許，加少量蒸餾水涂于玻片上，待自然干燥后用弱火焰固定，加甲醇于玻片上，半分鐘后傾去甲醇，置火焰上干燥，然后滴加0.5%堿性復(fù)紅液，并用酒精燈加熱至微見蒸氣維持1.5min,移去酒精燈，將