幾種霉菌生長過程的分形特征

幾種霉菌生長過程的分形特征

自1977年madworth提出了分形理論以來，尤其是近十年來，分形理論得到了迅速發(fā)展，成為非線性科學(xué)研究的一個(gè)非?；钴S的分支。與傳統(tǒng)幾何學(xué)相比,分形學(xué)理論能更真實(shí)、更深層次的描述自然界非線性系統(tǒng)中出現(xiàn)的不光滑和不規(guī)則的幾何形體的本質(zhì)特征。分形理論已經(jīng)廣泛應(yīng)用于諸多學(xué)科領(lǐng)域。在微生物領(lǐng)域,分形學(xué)還僅限于對細(xì)菌菌落分布的研究,如Shapiro以遺傳學(xué)研究技術(shù)用半乳糖苷顯色使大腸桿菌菌落里顯示出大小不等的多個(gè)扇狀面結(jié)構(gòu),Fujikawa在計(jì)算機(jī)上研究了微生物菌落的分形特征。徐啟旺等在生物波實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌、大腸桿菌及綠膿桿菌都可以形成大小不等的多個(gè)同心環(huán)狀菌落,表現(xiàn)出一種自相似性的特征。但有關(guān)真菌菌落在分形學(xué)方面的描述還未見報(bào)道。霉菌菌落的形態(tài)特征紛繁復(fù)雜,卻具有極其不規(guī)則性和自相似性,所以可以將分形學(xué)理論用來描述霉菌生長過程。分維數(shù)是描述具有分形特征的圖形和結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度的重要參數(shù)。本文作者利用分形理論對各個(gè)菌落的形態(tài)特征進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得到不同時(shí)間菌落的分維數(shù),從而繪制出霉菌生長過程的分維數(shù)隨時(shí)間的變化,證明了分維數(shù)可以用來定量描述霉菌的生長過程。同時(shí),也為分形理論運(yùn)用于其他微生物生長研究提供科學(xué)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌種保藏中心黑曲霉(Aspergilliumniger),大連輕工業(yè)學(xué)院菌種保藏中心提供。米曲霉(河內(nèi)白曲霉,Aspergillusoryzae),大連輕工業(yè)學(xué)院菌種保藏中心提供。根霉(Rhizopus),大連輕工業(yè)學(xué)院菌種保藏中心提供。產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum),大連輕工業(yè)學(xué)院菌種保藏中心提供。雅致小克銀漢霉(CunninghamellaelegansLendner),大連輕工業(yè)學(xué)院張春枝老師提供。深黃被包霉(Mortierellisabellina),大連輕工業(yè)學(xué)院張春枝老師提供。1.2一般培養(yǎng)基的制備和培養(yǎng)方法1.2.1kh2po4型水精液劑菌種活化采用PDA培養(yǎng)基,即200g土豆的煮出濾汁,20g葡萄糖,3g蛋白胨,1gKH2PO4,0.5gMgSO4·7H2O,補(bǔ)水至1000mL,加20g瓊脂。加熱熔化,裝試管,在121℃下滅菌30min,斜面接種各種霉菌,30℃培養(yǎng)。1.2.2固體平膏培養(yǎng)培養(yǎng)基配方同PDA培養(yǎng)基。接種各種霉菌后,30℃培養(yǎng)。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1傳統(tǒng)方法分析霉菌的生長過程的研究前人已經(jīng)做了大量的工作,但是定量描述霉菌生長過程的研究還不多見,大多數(shù)是定性的描述霉菌的生長過程。然而霉菌的菌落的形態(tài)非常復(fù)雜,用肉眼很難看清楚它們的千姿百態(tài),用語言也不可能把它們的形態(tài)特征描述的淋漓盡致,即使有些方法能夠從量的角度去描述霉菌的生長過程,也是非常復(fù)雜煩瑣的,而且也不夠準(zhǔn)確。傳統(tǒng)方法對霉菌生長過程的描述主要有平皿培養(yǎng)法和U形管培養(yǎng)法兩種方法。前者缺點(diǎn)是僅能測菌落的直徑或面積,不能包括菌落的厚度和生長在培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲,所以不能反映菌絲的總量。后者優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)時(shí)間可以很長且菌落不易污染,缺點(diǎn)與平皿法一樣,不能測菌絲的總量,不易挑出菌絲和孢子作檢查,且通氣不良。因此,迫切需要一種工具能夠定量地描述霉菌的生長過程。由于霉菌菌落的復(fù)雜性以及存在著自相似性,本實(shí)驗(yàn)把分形理論運(yùn)用到霉菌生長過程的研究。1.3.2產(chǎn)黃青霉菌種的采集將霉菌接在PDA培養(yǎng)基平皿中央,放入30℃恒溫箱里培養(yǎng)。定時(shí)對菌落進(jìn)行掃描采集圖像。對生長慢的菌可以一天掃描一次(產(chǎn)黃青霉);生長快的菌可以一天兩次(根霉、米曲霉、黑曲霉、深黃被包霉、雅致小克銀漢霉)。圖像采集時(shí)應(yīng)該注意的問題:(1)剛接種應(yīng)該立刻掃描,便于對比菌體生長過程的分維數(shù)的變化。(2)每次掃描時(shí)應(yīng)該將平皿提前15min拿出培養(yǎng)箱,使平皿與室溫平衡再進(jìn)行掃描。以免水霧影響圖像的清晰度。(3)每次掃描所選取的位置保持一致。1.3.3多媒體接口系統(tǒng)圖像處理系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)、圖像處理軟件Photoshop、多媒體接口系統(tǒng)。利用Photoshop軟件將圖像處理成256×256×8bit的灰度圖像,讀取圖像數(shù)據(jù),對其灰度值的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì),得出灰度分布的圖像。1.3.4基于數(shù)權(quán)的方法測量分維數(shù)目前,對分維數(shù)的定義有很多種,如Hausdorff維數(shù)、盒子維數(shù)(Box-countingDimension)、填充維數(shù)(PackingDimension)、分配維數(shù)(DividerDimension)等。計(jì)算方法也有很多種,如“香腸”法、“毯子”法、“腳規(guī)”法等。但經(jīng)常適用于二維圖像測量的方法是數(shù)盒子法(Box-countingDimension)。盒子維數(shù)的定義:設(shè)F是R的n維空間上任意的非空有界子集,N(F)是邊長為ε的可以覆蓋F集的最少立方體個(gè)數(shù),則F的盒維數(shù)Di為Di=lnN(F)/lnεDi=lnΝ(F)/lnε因?yàn)槊咕渚哂蟹中翁卣?本文作者采用盒子維法,測定菌落的分維數(shù)。用Photoshop軟件將圖像處理成256×256×8bit的灰度圖像,并以此圖像的灰度值作為第三維信息,建立256×256×256的立方體(盒子),統(tǒng)計(jì)覆蓋的盒子數(shù)和每個(gè)盒子含有灰度的級數(shù),計(jì)算出菌落的分維數(shù)。公式為:D=ln∑i=0255∑j=0255Nij/ln256D=ln∑i=0255∑j=0255Νij/ln2562結(jié)果與討論2.1照片。簡單的小金屬絲生長由于篇幅所限,僅討論雅致小克銀漢霉的生長過程。雅致小克銀漢霉菌落生長圖像見圖1。2.2菌落的分離、染色雅致小克銀漢霉用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng),接于平皿中央。雅致小克銀漢霉生長的速度很快,第2d就形成了直徑約1.8cm的菌落,第3d菌落直徑約6.0cm,菌落的中央向上凸起,頂?shù)狡矫笊w,灰白色,形成毛絨狀菌落。到第4d菌落張滿整個(gè)平皿(直徑10cm),菌落的顏色灰度加深。第5d以后菌落明顯開始衰亡,菌體萎縮,深灰色。2.3小克銀漢霉不同覆蓋條件對菌落基分布的影響由圖2可以看出,剛接上菌種(0h)時(shí)峰值出現(xiàn)在灰度值為60時(shí),這個(gè)峰值是培養(yǎng)基的特征峰。36h出現(xiàn)第2個(gè)峰,這表明菌體開始生長,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,菌體覆蓋在培養(yǎng)基上,第2個(gè)峰值逐漸增加而第1個(gè)峰值逐漸減少。62h時(shí)第1個(gè)峰完全消失,從第2個(gè)峰的形成到第1個(gè)峰的消失只用了1d。由此可以看出雅致小克銀漢霉生長速度非?？臁４撕?峰值在穩(wěn)定于灰度值95時(shí),這個(gè)峰是菌落的灰度分布。之所以會出現(xiàn)不同的2個(gè)峰,是因?yàn)榫涞念伾蛷?fù)雜度與培養(yǎng)基有很大的差別。2.3菌落分維數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化采用試驗(yàn)的條件,圖像的采集以及處理,分維數(shù)的計(jì)算與前面一致的方法對河內(nèi)白曲霉(米曲霉)、黑曲霉、根霉、產(chǎn)黃青霉、深黃被包霉等菌株的菌落圖像進(jìn)行處理,可以得出它們的菌落圖像的分維數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化如圖3所示。由圖3可以看出幾種菌種的菌落的分維數(shù)隨時(shí)間變化趨勢與前面實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論基本一致,菌落分維數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線與霉菌生長曲線基本一致,即經(jīng)過了延緩期、快速生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。這就說明了分形理論用于定量的描述和檢測菌體的生長狀況是可行的。從圖中還可以看出:菌落的生長快慢和形態(tài)變化的大小可以在菌落分維數(shù)的變化上體現(xiàn)出來。由圖可知產(chǎn)黃青霉生長得特別緩慢,而根霉生長非?？?。雅致小克銀漢霉和深黃被包霉菌落分維數(shù)變化曲線的趨勢相似,說明這兩種菌的菌落生長快慢和菌落形態(tài)及變化很相似,這與實(shí)驗(yàn)過程中觀察到的現(xiàn)象是吻合的。但是不同菌體在生長過程中不管多么相似,其分維數(shù)變化曲線是不同的,這為分形理論用于微生物菌種的篩選提供了可供參考的依據(jù)。綜上所述,用分形學(xué)的盒子維數(shù)來定量地描述相對比較復(fù)雜的霉菌菌落圖像是可行的,而且雅致小克銀漢霉、深黃被孢霉、河內(nèi)白曲等多數(shù)霉菌的菌落圖像的盒子維數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化符合生物群落