紫色毛霉發(fā)酵大豆的抗氧化能力研究

紫色毛霉發(fā)酵大豆的抗氧化能力研究

不僅含有豐富的養(yǎng)分，還包含許多具有生理功能的活性物質(zhì)。腐乳具有較好的生理功能,已見報道的有抗氧化、降血壓、降膽固醇等作用。目前在腐乳生產(chǎn)過程中,毛霉菌種的開發(fā)集中在常溫菌種,例如:雅致放射毛霉,總狀毛霉。但是,在我國一些氣溫相對較低的地區(qū),如東北地區(qū),可采用低溫型的菌種,如黑龍江省依安縣的一些腐乳加工作坊,就利用當(dāng)?shù)氐牡蜏貧夂?進行粗曠的腐乳生產(chǎn),即通過將簡單保存的菌絲體制成菌懸液,噴灑在白坯表面,在室內(nèi)約12℃發(fā)酵5d,然后鹽腌、后酵、成熟。二苯代苦味?；杂苫?DPPH:2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylhydrate)及2,2-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[ABTS:2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)]自由基清除試驗方法是檢測受試物抗氧化作用的常用方法。筆者分離出該腐乳的生成用菌,與腐乳生成常用菌-雅致放射毛霉對比,比較兩者生產(chǎn)得到的腐乳之間抗氧化能力的差異。1材料和方法1.1試劑與儀器黃色毛霉:腐乳菌絲體中分離純化;大豆(科豐六號):河北海興種子公司;雅致放射毛霉(編號AS3.227):中國工業(yè)微生物菌種中心;ABTS[2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)]、DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylhydrate)、Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic):美國Sigma公司;其他試劑:分析純,上?；瘜W(xué)試劑有限公司;FA1004型電子天平:上海天平儀器廠;TCL-16C型臺式離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠;FDU-54型冷凍干燥機:東京理化器械株式會社;550型96孔微板酶標(biāo)儀:日本Bio-RadLaboratories公司;WD4005型生化培養(yǎng)箱:哈爾濱東明醫(yī)療儀器制廠;I204型紫外分光光度計:日本島津公司;GL-20B型高速冷凍離心機:上海安亭實驗儀器廠。1.2測試方法1.2.1制作腐敗材料(1)水磨漿的加熱稱取挑選后的大豆800g,清洗3遍,加入2000g蒸餾水室溫下浸泡至豆粒飽滿,除去沒有被完全吸收的水分。8倍于大豆重量的水磨漿后,用通電加熱設(shè)備加熱至95℃,保持5min。稱取5000g熟豆?jié){冷卻至80℃,在80℃水浴鍋保溫10min后,攪拌中加1mol/L的氯化鎂溶液98mL,靜置蹲腦20min,用100×70×70的塑料敞口容器作為成型盒,先在3724Pa壓力下加壓10min,后在7448Pa壓力下加壓40min,降溫后切塊尺寸為30×30×10的白坯。(2)射毛霉接種量在豆腐白坯上分別接種黃色毛霉和雅致放射毛霉,接種量均為106個孢子/g。在溫度13℃和相對濕度90%的條件下培養(yǎng)84h后,經(jīng)過搓毛工序即為毛坯。(3)酵母粉添加量d在玻璃容器中放入毛坯,加入毛坯質(zhì)量15%的鹽,腌制5d即為鹽坯。添加后酵湯料包含有15%乙醇和6%鹽,封口。放于培養(yǎng)箱中,溫度為25℃濕度為75%。,發(fā)酵60d后得到黃色毛霉發(fā)酵腐乳和雅致放射毛霉發(fā)酵腐乳。1.2.2粉末解壓劑發(fā)酵成熟(后酵時間60d)的黃色毛霉發(fā)酵腐乳和雅致放射毛霉發(fā)酵腐乳,真空冷凍干燥后,研磨成粉末用于分析,樣品粉末置于4℃冰箱中保存。稱取1.000±0.005g凍干樣品粉末,加入10mL蒸餾水后,均質(zhì)(16000r/min,20s),在室溫下振蕩提取2h后,3000r/min下離心20min,取上清液重新離心4000r/min,20min,上清液為樣品溶液(濃度為100mg/mL)用于測定,樣液4℃保存?zhèn)溆谩?.2.3乳酸水提取與dpph法DPPH自由基清除能力的測定方法參考Shimadak的方法。腐乳水提取液的制備:將1.2.2中樣品液,用水逐級稀釋7個濃度,分別為30,25,20,15,10,5,2.5mg/mL。取不同濃度的腐乳水提取溶液1mL與1mLDPPH乙醇溶液(0.2mM)混合,20min后,在波長為517nm下,用紫外分光光度計測定吸光值,每個濃度做3個平行樣,測量后取平均值。計算清除率。清除率=[1-(A樣品/A樣品空白)]×100%式中:A樣品——加提取液反應(yīng)后DPPH溶液吸光度;A空白——用水代替提取液反應(yīng)后DPPH溶液吸光度。1.2.4abts清除活性的測定ABTS自由基清除能力的測定采用Roberta的方法改良進行,ABTS液的配置:用蒸餾水配置7mM的ABTS溶液,用蒸餾水配置140mM的高硫酸鉀溶液,分別取20mLABTS溶液和352μL高硫酸鉀溶液混合過夜之后,用乙醇將混合液稀釋至吸光值OD734為0.700±0.005,備用;將1.2.2中樣品液,用水逐級稀釋6個濃度,分別為10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.156mg/mL。取不同濃度腐乳提取液(樣品液),在96微孔板中,按表1加樣。在加入ABTS液20min后,在波長為405nm下,用96孔微板讀數(shù)器測定吸光值A(chǔ)。計算清除率。清除率=[1-(A樣品-A樣品空白)/(A陽性對照-A陰性對照)]×100%1.2.5抗氧化能力的測定取4mL的亞油酸乳化液(亞油酸2.51mL,乙醇100mL,0.05MpH7.0磷酸緩沖液8mL與3.9mL蒸餾水混合后超聲振蕩30min)與0.05mL樣品液(樣品液,BHT的濃度都為2mg/mL)在透氣試管中混合,放置于40℃培養(yǎng)箱中。每隔24h取出樣品不同濃度腐乳提取液0.1mL,依次加入75%乙醇溶液2mL,30%(W∶V)硫氰酸銨0.1mL,20mmol/L氯化亞鐵0.1mL,室溫下反應(yīng)3min后,測定其在500nm下的吸光值。吸光值越低表示樣品抗氧化能力越強,試驗以BHT為標(biāo)準(zhǔn)品。每組為3個平行樣,測量后取平均值。1.2.6樣品還原能力測定腐乳提取液還原能力的測定方法參考Yencc的方法。將1.2.2中樣品液,用水逐級稀釋6個濃度,分別為100,60,30,15,7.5,3.75mg/mL。取0.4mL不同濃度腐乳提取液,加0.4mL0.2M磷酸緩沖液(pH=6.6)及1%鐵氰化鉀0.4mL于2mL離心管中混合均勻后,于50℃下靜置20min,再加0.4mL的10%三氯乙酸,混合后離心(6000g,10min)。取上清液1mL,加1mL蒸餾水和0.1%的三氯化鐵溶液0.2mL混合均勻,室溫下反應(yīng)10min后,測定其在700nm下的吸光值。吸光值越高表示樣品還原能力越強,試驗以BHT為標(biāo)準(zhǔn)品。每組為3個平行樣,測量后取平均值。2結(jié)果與討論2.1dpph自由基清除能力黃色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的DPPH的清除能力見圖1,ABTS清除能力見圖2。圖1中黃色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳表現(xiàn)出較好的DPPH自由基清除能力,在濃度為30mg/mL的時候兩者的DPPH清除率分別為98.24%和82.36%。從結(jié)果上來看,黃色毛霉腐乳DPPH清除能力高于雅致放射毛霉腐乳的DPPH清除能力。圖2反映了黃色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的ABTS的清除能力。黃色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的ABTS清除能力也存在差異,在相同濃度(2.5mg/mL)下黃色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的ABTS清除率分別為76.25%和69.39%。在濃度為10mg/mL時,兩種腐乳的ABTS清除率分別為82.44%和82.81%,無顯著性差異。黃色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳具有一定的ABTS自由基清除能力。此DPPH、ABTS抑制試驗證實,腐乳具有很好的自由基清除能力,并且黃色毛霉腐乳的自由基清除能力略高于雅致放射毛霉。2.2提取液和提取液對d黃色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳在亞油酸系統(tǒng)中的抗氧化能力見圖3。對照組(不添加任何抗氧化劑)中,亞麻酸的過氧化程度在6d的孵育過程中明顯升高,各個時期的示數(shù)都高于試驗組。添加有BHT、黃色毛霉腐乳提取液和雅致放射毛霉腐乳提取液的亞油酸在6d的氧化過程中,過氧化程度增加幅度較小。試驗的第6天,它們的亞油酸氧化抑制率分別為46.5%,30.2%和22.6%,說明三者都可以抑制亞油酸的過氧化,且黃色毛霉腐乳的亞油酸氧化抑制能力強于雅致放射毛霉腐乳提取液的抑制能力(p<0.05)。2.3還原力的測定黃色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的還原能力見圖4。黃色毛霉發(fā)酵腐乳和雅致放射毛霉發(fā)酵腐乳的還原能力皆隨著濃度的升高而增加,濃度跨度為4～100mg/mL,還原能力的變化分別由0.195升至2.543,0.190升至2.553。標(biāo)準(zhǔn)品BHT的劑量在達(dá)到1mg/mL時其還原力到達(dá)最高值且呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。在相同濃度(100mg/mL)時,BHT,黃色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的還原能力分別為2.934,2.543和2.553。結(jié)果表明:黃色毛霉腐乳與雅致放射毛霉腐乳的還原能力相比,沒有顯著性差異(p<0.05)。腐乳提取物的還原能力在低濃度時顯著的低于BHT,但在提高濃度的情況下,幾乎可以達(dá)到與BHT相當(dāng)?shù)倪€原能力。說明腐乳提取物可以憑借其還原能力,作為電子供體與自由基反應(yīng),使之轉(zhuǎn)換為更穩(wěn)定的物質(zhì),從而達(dá)到中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),起到抗氧化的作用。3自由基清除能力毛霉腐乳和黃色毛霉腐乳