發(fā)酵豆渣中添加黑曲霉的菌株篩選及安全性評價

發(fā)酵豆渣中添加黑曲霉的菌株篩選及安全性評價

中國是一個傳統(tǒng)的食用肉類大國。隨著對大豆?fàn)I養(yǎng)的深入理解，其國民消費(fèi)也在增加。作為傳統(tǒng)大豆生產(chǎn)的副產(chǎn)品，豆渣每處理1噸大豆產(chǎn)生2.5萬噸豆渣。目前，中國每年約有1500萬噸豆渣。中國的大豆蛋白含量很高，適合生產(chǎn)蛋白質(zhì)，如豆腐等。因此，政府對未來中國的豆場產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)提出了指導(dǎo)意見，這將有助于以后的非壓縮行業(yè)。隨著豆渣的增加，由于口感粗糙，水分含量高，容易腐敗，耐儲存，因此大部分用于飼料和直接浪費(fèi)，食用不足，造成資源浪費(fèi)。豆渣含有豐富的蛋白質(zhì)、Ca等礦物質(zhì)和其他營養(yǎng)成分,另外還富含膳食纖維,對于預(yù)防腸道癌變、便秘、減肥具有良好功效.不僅如此,近年來研究還發(fā)現(xiàn),發(fā)酵豆渣具有抗氧化、降低血液中膽固醇含量、減少糖尿病患者對胰島素的消耗等功效.目前豆渣在食品工業(yè)中主要有兩種利用途徑:一是烘干粉碎后作為添加輔料用于食品加工,如膨化食品、烘烤食品;二是以豆渣為原料提取豆渣中的保健功能成分如膳食纖維等.但干燥豆渣能耗大,另外豆渣顆粒大也直接限制了豆渣在食品中的添加量;而提取過程中需要經(jīng)過酸堿等多種工序處理,易造成環(huán)境污染,也不利于豆渣的有效利用.改善豆渣口感需要使豆渣粒徑變小.目前,減小豆渣粒徑主要為機(jī)械粉碎法.機(jī)械粉碎法能耗高,費(fèi)用大,且豆渣膳食纖維抵抗變形和吸收沖擊能的能力大,即使通過傳統(tǒng)的粉碎設(shè)備(如砂輪磨、膠體磨等)也很難將豆渣顆粒粉碎到足夠小.發(fā)酵利用微生物對纖維素、半纖維素等的降解,不僅可減少豆渣顆粒大小,而且可以直接把豆渣做成味噌那樣的豆渣醬,增加風(fēng)味和營養(yǎng).如雅致放射毛霉等可改善豆渣口感,但因口感粗糙仍需要機(jī)械粉碎后才能作為食品原料.所以有必要篩選出更加有效降低豆渣渣感,改善口感的菌株.為此,本文以雅致放射毛霉為參照菌株,利用從腐乳、豆醬、豆豉、霉豆渣、醬油渣中分離純化菌株發(fā)酵豆渣,考察了不同菌株發(fā)酵豆渣過程中渣感變化,篩選出能發(fā)酵豆渣渣感低于雅致放射毛霉發(fā)酵豆渣的菌株霉菌M122;通過ITS法和外部形態(tài)學(xué)觀察法對該霉菌M112進(jìn)行菌株鑒定;雖然1987年美國食品藥品監(jiān)督局把黑曲霉列入食品安全菌株,但基于最近黑曲霉種群產(chǎn)生赭曲霉毒素A的研究時有報導(dǎo),還測定了霉菌M112發(fā)酵10d豆渣中赭曲霉毒素A含量.本研究為綜合利用豆渣提供了新方法.1材料和方法1.1含水率新鮮豆渣由北京王致和食品集團(tuán)有限公司提供,樣品取自王致和腐乳廠生產(chǎn)線,含水率為82.13%;發(fā)酵菌種詳見表1.為判斷分離菌株對于發(fā)酵后豆渣渣感降低程度,以北京市食品釀造所提供的雅致放射毛霉(Actinomucorelegans3.118)為篩選參照菌株.共181株菌.1.2儀器、檢測方法HZQ-F160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);YXQ-LS-50型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);LTI-601SD型低溫恒溫培養(yǎng)箱(日本東京理化器械株式會社);S-3400N型掃描顯微鏡(日本日立公司);SZ×12+PM10AK型數(shù)碼顯微鏡(奧林巴斯(日本)有限公司);TS5BS4型高速勻質(zhì)機(jī)(IKAlabortechnik,Germangy);TCL-16C型臺式冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);510M-01型多參數(shù)測定儀(Thermo.Scientifico.Co.Ltd.USA);050-801TGradient96型PCR儀(德國Whatman/Biometra公司);ABI3730XL型測序儀(美國AppliedBiosystems);LC-10A型高壓液相色譜儀(日本島津公司,配有NCI900熒光檢測器);DC12型氮?dú)獯蹈蓛x(上海安譜科學(xué)儀器有限公司).1.3豆渣發(fā)酵試驗(yàn)1.3.1降低豆渣渣感菌株的篩選首先制備菌懸液,將發(fā)酵菌株分別在相應(yīng)斜面培養(yǎng)基上活化,再分別挑取活化好的菌株進(jìn)行擴(kuò)培培養(yǎng),活化和擴(kuò)培條件見表2.最后向三角瓶加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水,振蕩后用無菌紗布過濾,將濾液收集到三角瓶中并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水適當(dāng)稀釋,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),制成2×107～5×107個/mL孢子懸浮液備用.豆渣發(fā)酵試驗(yàn)方法:分別稱取130g新鮮豆渣于1000mL的三角瓶中,6層紗布封口,在121℃高壓滅菌鍋內(nèi)蒸煮20min,冷卻至室溫后,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%菌懸液,以加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%無菌水的豆渣作為對照(未發(fā)酵豆渣),混勻后按不同菌種在設(shè)定的溫度、濕度條件下置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱發(fā)酵,具體為:霉菌和酵母菌發(fā)酵溫度為28℃、相對濕度為95%;細(xì)菌發(fā)酵溫度為37℃,相對濕度為95%.發(fā)酵時間10d,每隔24h取樣1次,依次得到不同菌株發(fā)酵豆渣和未發(fā)酵豆渣樣品.然后對未發(fā)酵豆渣樣品(0d)和不同菌株發(fā)酵豆渣發(fā)酵過程中豆渣渣感變化進(jìn)行打分,并對發(fā)酵10d時豆渣風(fēng)味、色澤進(jìn)行描述.1.3.2霉菌M122的ITS法鑒定對降低豆渣渣感效果最好菌株霉菌M122進(jìn)行ITS法鑒定.1.3.3霉菌M122的形態(tài)學(xué)觀察對霉菌M122進(jìn)行菌落形態(tài)特征觀察、菌體特征及孢子結(jié)構(gòu)觀察.1.3.4赭曲霉毒素A測定對霉菌M122發(fā)酵10d的豆渣樣品,進(jìn)行赭曲霉毒素A含量的測定.1.4pcr擴(kuò)增及序列分析1.4.1降低豆渣渣感菌株的篩選方法分別取豆渣樣品10g放于盤中,并隨機(jī)編號,選20名(男女各半,年齡20～28歲)本研究室經(jīng)過培訓(xùn)的評價人員獨(dú)立完成感官品評,分別在感官品評室內(nèi)對編號樣品的渣感依據(jù)打分標(biāo)準(zhǔn)打分,并記錄樣品的風(fēng)味.渣感具體評分標(biāo)準(zhǔn)為:強(qiáng)(0～20),較強(qiáng)(21～40),中(41～60),較弱(61～80),弱(81～100).1.4.2霉菌M112的ITS法菌株鑒定DNA的提取方法:參照Wang等的方法.PCR擴(kuò)增:根據(jù)真菌整個ITS區(qū)設(shè)計(jì)通用引物:ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG,ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC,以霉菌的DNA基因組為模板,擴(kuò)增全全長序列的ITS.PCR在50μL的混合液中進(jìn)行,混合液中含有2.3μL基因組DNA,5μLPCR緩沖液,1μLdNTP(1mmol/L),2μL引物(1.0×10-11mol/μL),0.7μLTaq聚合酶(2U/μL)和37μL超純無菌水.PCR條件:95℃、1min,95℃、30s55℃、30s,72℃、40s,30個循環(huán);最后72℃延伸10min.DNA序列測定、序列比對:PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙稀酰胺凝膠電泳后,由上海Genecore生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序.然后將DNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了比對分析.1.4.3霉菌M122的菌株形態(tài)學(xué)鑒定菌落特征觀察:采用三點(diǎn)法,將篩選出的待測菌株點(diǎn)種在察氏培養(yǎng)基上,置于28℃條件下暗培養(yǎng),并開始觀察其菌絲生長速度、色澤變化和孢子顏色等.菌體特征及出孢子結(jié)構(gòu)觀察:取載玻片加乳酸-苯酚液1滴,用接種針鉤取一小塊霉菌培養(yǎng)物,置于乳酸-苯酚液中,用2支分離針將培養(yǎng)物撕成小塊,加蓋玻片.用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu);選取培養(yǎng)物2.5%戊二醛固定,然后依次分別用體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、95%、99.5%的乙醇溶液梯度脫水、真空噴金等處理后在掃描電子顯微鏡下觀察霉菌的菌絲和孢子的形態(tài)特征,孢子的排列.1.4.4赭曲霉毒素A(OchratoxinA,OTA)測定對鑒定菌株發(fā)酵10d的豆渣樣品進(jìn)行赫曲霉毒素A含量的測定,方法參考GB/T23501—2009.1.5處理數(shù)據(jù)試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)用平均值表示.不同處理之間用SPSS16.0軟件采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,顯著性水平為0.05.2結(jié)果與分析2.1不同菌種對豆渣渣感的影響利用不同菌株發(fā)酵豆渣(由于菌株較多,未能全部列出),其發(fā)酵過程中的渣感變化如圖1所示.由圖1可知,未發(fā)酵豆渣渣感強(qiáng),而經(jīng)過不同菌株發(fā)酵后的豆渣,渣感在整個發(fā)酵過程中逐漸減弱其中霉菌前5d發(fā)酵豆渣感減少速度較快,其中,霉菌M112發(fā)酵豆渣在5d時,渣感強(qiáng)度由強(qiáng)降至弱渣感程度;雅致放射毛霉發(fā)酵豆渣在5d時,渣感強(qiáng)度由強(qiáng)降低到中等渣感程度.這說明發(fā)酵可以降低豆渣渣感,發(fā)酵前5d發(fā)酵豆渣感減少速度快,后期趨于穩(wěn)定,霉菌M112發(fā)酵豆渣改善渣感的效果好于雅致放射毛霉發(fā)酵豆渣.由圖1還可以看出,霉菌、酵母菌和細(xì)菌發(fā)酵豆渣,其渣感降低程度不同.酵母菌和細(xì)菌發(fā)酵對于豆渣渣感改善程度較小,發(fā)酵10d時,豆渣仍有強(qiáng)渣感;霉菌發(fā)酵豆渣好于酵母菌和細(xì)菌;不同霉菌發(fā)酵豆渣,渣感降低也有顯著性差異,霉菌M35、霉菌M36發(fā)酵10d時,渣感仍較強(qiáng),而霉菌M112和雅致放射毛霉發(fā)酵豆渣10d時,渣感分別降到弱和極弱的程度.霉菌M112發(fā)酵豆渣,其渣感降低的程度和速度均好于雅致放射毛霉.這可能與發(fā)酵后豆渣粒徑變小有關(guān).有文獻(xiàn)報導(dǎo),雅致放射毛霉發(fā)酵可使豆渣口感細(xì)膩,釀酒酵母發(fā)酵也能改善豆渣適口性.從圖1可看出,用本試驗(yàn)篩選出的霉菌M112發(fā)酵豆渣比雅致放射毛霉、酵母菌發(fā)酵豆渣的渣感降低到極弱的程度,口感更加細(xì)膩.雅致放射毛霉制作豆渣醬仍需要機(jī)械粉碎后,才能做出消費(fèi)者口感能接受的產(chǎn)品霉菌M122不用機(jī)械粉碎即能達(dá)到此效果.本文對霉菌、細(xì)菌、酵母菌改善豆渣渣感的能力做了系統(tǒng)研究,也為以后降低豆渣渣感應(yīng)從霉菌中篩選目標(biāo)菌株指明了方向.對M122發(fā)酵10d豆渣和未發(fā)酵豆渣的風(fēng)味進(jìn)行記錄,未發(fā)酵豆渣色澤均為乳白色,固體,有豆香M122發(fā)酵10d豆渣呈黑色,醬狀流體,略有發(fā)酵香氣.鑒于霉菌M112發(fā)酵豆渣渣感極弱,口感改善效果最佳,又有發(fā)酵香氣的緣故,可作為豆渣發(fā)酵的良好菌株,有必要對其進(jìn)行鑒定.2.2抗混合型真菌的構(gòu)建霉菌M112測序結(jié)果如下:TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTATACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTTTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTTTTCCAGGTGACCTCGATCGAGCGG待鑒定菌株的ITS序列通過在GenBank中進(jìn)行比對,結(jié)果為黑曲霉(AspergillusnigerM112),屬于曲霉屬(Aspergillus)、環(huán)繞亞屬(Subgen.Circumdati)、黑色組(Seet.Nigri)真菌(同源性大于99%).2.3加味劑霉菌M112在28℃察氏培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和菌絲、孢子囊、孢子形態(tài)見圖2.由圖2可知,該菌株在察氏培養(yǎng)基上生長極為迅速;菌絲初為白色,后來變?yōu)楹谏?菌落平坦,質(zhì)地呈絮狀,松散,較厚;頂部形成球形頂囊,其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗,小梗上長有成串褐黑色的球狀直徑2.5~4.0μm.頂囊大球形,分生孢子量大,呈黑色顆粒狀.分生孢子頭呈明顯球狀,直徑700~800μm褐黑色,具有典型的黑曲霉的形態(tài)特征,這也與ITS法鑒定結(jié)果相一致.黑曲霉因有產(chǎn)生纖維素酶和果膠酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、半纖維素酶酶等多種酶的能力而被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè),這也是黑曲霉能有效降低發(fā)酵豆渣渣感、改善豆渣口感的原因.黑曲霉已應(yīng)用于醬油和豆醬的生產(chǎn)中,但黑曲霉發(fā)酵豆渣生產(chǎn)豆渣醬還未見報道.2.4治療前后用黑曲霉毒素a檢測對黑曲霉發(fā)酵10d豆渣的赭曲霉毒素A含量進(jìn)行了測定,其赭曲霉毒素A含量為未檢出,國際上谷物及其產(chǎn)品中的OTA限量范圍在3~5μg/kg,這說明黑曲霉在發(fā)酵豆渣中沒有產(chǎn)生赭曲霉毒素A為食品安全菌株.3最佳發(fā)酵10d豆渣的確定本研究結(jié)果表明:用不同菌株發(fā)酵豆渣后,發(fā)酵豆渣渣感均比未發(fā)酵豆渣渣感降低,口感改善;霉菌發(fā)酵豆渣渣感降低程度大于細(xì)菌、酵母菌發(fā)酵豆渣.從醬油渣中選出