補(bǔ)脾方藥對脾虛證模型大鼠胃泌素受體及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

補(bǔ)脾方藥對脾虛證模型大鼠胃泌素受體及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

胃素是一種養(yǎng)分激素，主要用于刺激胃腸粘膜，包括上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)、壁細(xì)胞的分泌、嗜鉻細(xì)胞的（ecl細(xì)胞）的分離，以及刺激產(chǎn)生表皮生長因子家族的產(chǎn)物。脾虛證研究發(fā)現(xiàn)胃腸黏膜上皮等組織結(jié)構(gòu)有顯著的異常表現(xiàn),胃腸激素包括前列腺素、胃泌素與生長抑素、表皮生長因子含量異常。壁細(xì)胞是胃底腺分泌細(xì)胞的一種,并被證實其表達(dá)胃泌素受體,因此,我們在已建立大鼠胃壁細(xì)胞分離純化方法及胃泌素受體放射配基結(jié)合分析法的基礎(chǔ)上,對脾虛大鼠胃泌素受體結(jié)合位點數(shù)及受體后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化進(jìn)行觀察,并在補(bǔ)脾法指導(dǎo)下運用健脾益氣方藥黨參、白術(shù)、補(bǔ)中益氣湯治療,探討脾虛證病理機(jī)制及補(bǔ)脾方藥的作用。1材料表面1.1蛋白質(zhì)和氨基酸I-胃泌素(中國原子能科學(xué)研究院同位素室提供,放射性比活度為1700Ci/mmol,放化純度>95%);[Leu15]Gastrin-17(Sigma公司產(chǎn)品);鏈霉蛋白酶(Pronase,Sigma公司產(chǎn)品);Percoll(Pharmacia公司產(chǎn)品);Fura-2/AM(Biotium公司產(chǎn)品);玻璃纖維濾膜(上海紅光造紙廠生產(chǎn))。1.2蒸發(fā)濃縮10%唐古特大黃(紗布包裹,加適量蒸餾水,置60℃恒溫箱內(nèi)24小時,倒出濾液,水浴蒸發(fā)濃縮至100%備用);黨參、白術(shù)水煎液(66%);補(bǔ)中益氣湯(組成:黨參10g,黃芪20g,白術(shù)10g,當(dāng)歸10g,陳皮6g,柴胡3g,升麻3g,炙甘草5g,水煎液100%)。1.3u3000ds-1熒光分光光度計HYS-4型多頭細(xì)胞收集器;SN-695B型智能放免γ測量儀(計數(shù)效率70%);LS-55熒光分光光度計(Perkinelmer公司產(chǎn)品);XDS-1倒置顯微鏡;HZS-H恒溫水浴振蕩器;TDZ5-WS低速離心機(jī);HJ-6多頭磁力攪拌器等。2方法2.1動物分組及處理u2005雄性SD大鼠,體重180～200g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,合格證號:2004-A021,大鼠按體重隨機(jī)分成5組,即正常對照組、模型組、黨參組、白術(shù)組、補(bǔ)中益氣湯組。模型組用100%大黃水浸液1ml/100g灌胃大鼠,每天2次(間隔8小時),連續(xù)14天。黨參組、白術(shù)組、補(bǔ)中益氣湯組于造模第11天開始分別給予相應(yīng)的中藥煎劑1ml/100g,連續(xù)4天,正常對照組給予等量蒸餾水。第15天處死動物,分離壁細(xì)胞,由于細(xì)胞分離過程操作煩瑣,故各組造模隔日進(jìn)行。2.2細(xì)胞黏膜的分離參照本實驗室的方法。大鼠脫頸椎處死(不禁食),分別結(jié)扎賁門和幽門取胃,在胃底剪開小口,將胃翻轉(zhuǎn)結(jié)扎形成翻轉(zhuǎn)胃袋。冰冷生理鹽水沖洗后注入消化液(A液+Pronase)。將胃袋放入A液(NaH2PO4,Na2HPO4,NaHCO3,NaCl,KCl,HEPES,Glucose,BSA,EDTA)中消化90分鐘,同時37℃水浴振蕩(100次/分),通入95%O2和5%CO2,然后將胃袋放入B液(NaH2PO4,Na2HPO4,NaHCO3,NaCl,KCl,HEPES,Glucose,BSA,CaCl2,MgCl2)中在磁力攪拌作用下分散胃黏膜細(xì)胞,10分鐘后尼龍濾膜(200目)過濾B液,離心(900～1000轉(zhuǎn)/分)收集細(xì)胞。此過程重復(fù)5次,將所有收集的胃黏膜細(xì)胞用C液(B液+DTT)混懸,利用40%、60%Percoll進(jìn)行非連續(xù)密度梯度離心,收集60%層面的細(xì)胞。2.3[leu15]gastin-175參考文獻(xiàn)、。將壁細(xì)胞懸液調(diào)整為濃度(1～2)×106/ml,根據(jù)預(yù)示多點結(jié)合實驗確定125I-胃泌素飽和終濃度為300pM,并以此為基礎(chǔ)做單點結(jié)合實驗,計算各組大鼠胃壁細(xì)胞上胃泌素受體結(jié)合位點數(shù)。非特異結(jié)合管分別加入125I-胃泌素15μl、[Leu15]Gastrin-1715μl、壁細(xì)胞混懸液170μl,總結(jié)合管則用冰冷的C液15μl代替[Leu15]Gastrin-17,其余加樣同非特異結(jié)合管。樣品加樣后37℃孵育30分鐘(輕微振蕩),加冰冷C液800μl終止反應(yīng),迅速用多頭細(xì)胞收集器抽濾至玻璃纖維濾膜(用含0.1%BSA的PBS浸泡過夜),再用C液2ml淋洗濾膜3次,50℃烘干濾膜,打孔,放入一次性塑料管中計數(shù)每分鐘結(jié)合位點數(shù)。每管均設(shè)復(fù)管。計算方法:特異結(jié)合(SB)=總結(jié)合(TB)-非特異性結(jié)合(NSB)。位點/細(xì)胞=每分鐘特異結(jié)合位點數(shù)×6.022×1023計數(shù)效率×2.2×106×放射比度×放化純度×109×細(xì)胞數(shù)位點/細(xì)胞=每分鐘特異結(jié)合位點數(shù)×6.022×1023計數(shù)效率×2.2×106×放射比度×放化純度×109×細(xì)胞數(shù)2.4細(xì)胞內(nèi)[ca2+[表達(dá)變化的測定](1)Fura-2/AM的負(fù)載:純化后的壁細(xì)胞活率達(dá)90%以上,每2ml[(1～2)×106/ml]細(xì)胞懸液加入終濃度為1μmol/LFura-2/AM,37℃避光孵育30分鐘,離心(10000轉(zhuǎn)/分,5分鐘),加入C液再離心,重復(fù)2次洗去殘存細(xì)胞外液的Fura-2/AM,重新加入2mlPBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/ml,用LS-55熒光分光光度計測定細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i。整個測試過程中細(xì)胞懸液處于攪拌狀態(tài),且外環(huán)境保持在37℃。(2)壁細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的測定:采用雙波長熒光分光光度法,將負(fù)載Fura-2的細(xì)胞懸液2ml加入分光光度計的石英小槽內(nèi),分別測定給藥前后的熒光強(qiáng)度變化。測定參數(shù)為:激發(fā)波長340nm和380nm,發(fā)射波長510nm,狹縫5nm。[Ca2+]i的計算公式:[Ca2+]i=Kd×(Sf2/Sb2)×[(R-Rmin)/(Rmax-R)]。Kd為Fura-2與Ca2+反應(yīng)的解離常數(shù),為224nmol/L;R為每次所測得的熒光比值;Sf2為在無Ca2+狀態(tài)下380nm激發(fā)的熒光強(qiáng)度;Sb2為在飽和Ca2+狀態(tài)下380nm激發(fā)的熒光強(qiáng)度;Rmax為Fura-2的所有結(jié)合部位均為Ca2+所飽和,即緩沖液中加入TritonX-100(終濃度0.1%)所測得的340nm/380nm;Rmin為所有Fura-2均為游離形式時所測得的熒光比值,即過量的EGTA存在下(終濃度為5mmol/L,pH值>8.5)所測得的340nm/380nm。2.5統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗。3結(jié)果3.1各組患者治療前后位未除氣湯組以養(yǎng)血藥、補(bǔ)中益氣湯組治療前后療效比較表1示,模型組大鼠壁細(xì)胞胃泌素受體結(jié)合位點數(shù)顯著下降(P<0.05),經(jīng)黨參、白術(shù)、補(bǔ)中益氣湯治療后有所升高,以白術(shù)組和補(bǔ)中益氣湯組較為明顯(P<0.05)。3.2組壁細(xì)胞內(nèi)[ca2+]i表達(dá)水平比較表2示,靜息狀態(tài)下,模型組大鼠壁細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i明顯低于正常組(P<0.01),經(jīng)治療后3組壁細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i均有所升高,但差異無顯著性。各組均加入[Leu15]-Gastrin(終濃度0.1μmol/L)刺激后,細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i均有所升高,且模型組與黨參組升高幅度與正常對照組比較差異有顯著性(P<0.05)。4對胃泌素受體的作用脾虛證是中醫(yī)臨床常見的一類證候,是以消化道病理改變和功能障礙為主,累及神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的全身性病理狀態(tài)。20世紀(jì)80年代以來,脾虛證與胃腸激素關(guān)系的研究逐漸增多,其中血清及胃黏膜中胃泌素水平與脾虛證關(guān)系的報道很多,但結(jié)果不甚一致。胃泌素的生物效應(yīng)是通過胃泌素受體介導(dǎo)的,因此本實驗從離體壁細(xì)胞上的胃泌素受體入手,利用受體放射配基結(jié)合實驗研究脾虛模型大鼠胃泌素受體表達(dá)及受體后信號傳遞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),脾虛模型大鼠壁細(xì)胞胃泌素受體結(jié)合位點數(shù)較正常大鼠明顯降低,與我們前期實驗利血平脾虛模型表現(xiàn)一致,而經(jīng)黨參、白術(shù)、補(bǔ)中益氣湯治療后有所升高,以白術(shù)和補(bǔ)中益氣湯尤為顯著,與以往報道經(jīng)黃芪注射液治療效果一致,提示胃泌素受體低表達(dá)可能與脾虛證相關(guān),而健脾益氣方藥對其有顯著上調(diào)作用。鈣離子是細(xì)胞生理功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ),細(xì)胞內(nèi)自由Ca2+的分布和轉(zhuǎn)移是形成Ca2+信號的基礎(chǔ)。一般認(rèn)為,細(xì)胞對許多外界環(huán)境和激素等刺激作出的反應(yīng)是通過胞質(zhì)中自由Ca2+濃度變化來傳遞的,Ca2+在細(xì)胞內(nèi)起到信使的作用。當(dāng)受到刺激時,細(xì)胞外Ca2+通過Ca2+通道的開啟進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)鈣庫(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))向細(xì)胞質(zhì)中釋放出Ca2+。熒光測定法是研究細(xì)胞內(nèi)鈣變化的一種重要方法,其中Fura-2是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的第二代鈣熒光指示劑,是典型的雙激發(fā)熒光指示劑,與鈣結(jié)合后導(dǎo)致熒光光譜移動,當(dāng)被Ca2+飽和后,340nm處激發(fā)熒光強(qiáng)度上升3倍,而380nm處激發(fā)熒光強(qiáng)度下降10倍,故二者熒光強(qiáng)度比值能夠較準(zhǔn)確地反映Ca2+濃度。已有研究表明,壁細(xì)胞表面有多種受體存在,包括胃泌素受體、H2受體、膽堿受體等,它們的激動劑可分別作用于各自的受體導(dǎo)致壁細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i增高而引發(fā)促酸分泌功能。研究發(fā)現(xiàn),組胺、卡巴可、胃泌素、膽囊收縮素-8(CCK-8)可引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高,其機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放。本實驗利用大鼠即時分離的壁細(xì)胞,經(jīng)非連續(xù)密度梯度離心純化后壁細(xì)胞純度可達(dá)到75%,觀察脾虛模型大鼠壁細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i變化及經(jīng)胃泌素刺激后的變化,結(jié)果表明,模型組大鼠胃壁細(xì)胞內(nèi)靜息狀態(tài)[Ca2+]i明顯低于正常對照組,經(jīng)胃泌素刺激后,[Ca2+]i增高且模型組增高幅度明顯高于正常對照組,提示脾虛模型大鼠壁細(xì)胞雖然處