血紅蛋白的提取和分離

㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：一基礎知識㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：2、概念：一基礎知識㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內含許多貫穿的通道，由多糖類構成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠又叫分子篩）2、概念：

根據被分離物質的蛋白質相對分子質量的大小，利用具有網狀結構的凝膠分子篩作用，來進行分離。一基礎知識凝膠色譜法分離蛋白質的原理1、概念：

在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：1、概念：

在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：能夠抵制對溶液的的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值3、緩沖溶液的配制通常由種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內使用的緩沖液。1－2㈢電泳：1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2、原理：許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團

在一定的PH下，這些基團會帶上一定的PH。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身大小、形狀的不同使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。分類：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。分類：聚丙烯酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑(過硫酸銨）和催化劑（四甲基已二胺）的作用下聚合交聯(lián)成三維網狀結構的凝膠瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。分類：蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。

為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入()。SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是()。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于()。

為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入()。SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是()。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于()。SDS

為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入()。SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是()。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于()。SDS單條肽鏈的分子量

為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入()。SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是()。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于()。SDS單條肽鏈的分子量分子的大小測定（）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定（）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質相對分子質量用雞的紅細胞提取DNA，用哺乳動物的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？二實驗操作用雞的紅細胞提取DNA，用哺乳動物的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提?。蝗说募t細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。二實驗操作蛋白質的提取和分離一般分為四步：1.樣品處理樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定二實驗操作血液有哪些成分？血液血

漿水分其他

物質血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血

細胞白細胞血小板紅細胞(最多)血紅蛋白(90％)兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團血液有哪些成分？血紅蛋白每個肽鏈環(huán)繞()，此基團可攜帶()。血紅蛋白因含有()而呈紅色。每個肽鏈環(huán)繞()，此基團可攜帶()。血紅蛋白因含有()而呈紅色。一個亞鐵血紅素基團每個肽鏈環(huán)繞()，此基團可攜帶()。血紅蛋白因含有()而呈紅色。一個亞鐵血紅素基團一分子氧或一分子二氧化碳每個肽鏈環(huán)繞()，此基團可攜帶()。血紅蛋白因含有()而呈紅色。一個亞鐵血紅素基團一分子氧或一分子二氧化碳血紅素①目的：去除()②方法：

()離心(速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果)，然后用膠頭吸管吸出上層透明的()，將下層()的紅細胞液體倒入燒杯，再加入

用()的()洗滌。(1)紅細胞的洗滌①目的：去除()②方法：

()離心(速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果)，然后用膠頭吸管吸出上層透明的()，將下層()的紅細胞液體倒入燒杯，再加入

用()的()洗滌。(1)紅細胞的洗滌雜質蛋白①目的：去除()②方法：

()離心(速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果)，然后用膠頭吸管吸出上層透明的()，將下層()的紅細胞液體倒入燒杯，再加入

用()的()洗滌。(1)紅細胞的洗滌雜質蛋白低速短時間①目的：去除()②方法：

()離心(速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果)，然后用膠頭吸管吸出上層透明的()，將下層()的紅細胞液體倒入燒杯，再加入

用()的()洗滌。(1)紅細胞的洗滌雜質蛋白低速短時間黃色血漿①目的：去除()②方法：

()離心(速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果)，然后用膠頭吸管吸出上層透明的()，將下層()的紅細胞液體倒入燒杯，再加入

用()的()洗滌。(1)紅細胞的洗滌雜質蛋白低速短時間黃色血漿暗紅色①目的：去除()②方法：

()離心(速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果)，然后用膠頭吸管吸出上層透明的()，將下層()的紅細胞液體倒入燒杯，再加入

用()的()洗滌。(1)紅細胞的洗滌雜質蛋白低速短時間黃色血漿暗紅色五倍體積①目的：去除()②方法：

()離心(速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果)，然后用膠頭吸管吸出上層透明的()，將下層()的紅細胞液體倒入燒杯，再加入

用()的()洗滌。(1)紅細胞的洗滌雜質蛋白低速短時間黃色血漿暗紅色五倍體積生理鹽水

重復洗滌()次，直至上清液中已沒有()，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數過少。

重復洗滌()次，直至上清液中已沒有()，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數過少。三

重復洗滌()次，直至上清液中已沒有()，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數過少。三黃色初次離心后的結果3次洗滌后的結果

加()到()體積，再加40％體積的()(溶解細胞膜)，置于()上充分攪拌10分鐘(加速細胞破裂)，細胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放

加()到()體積，再加40％體積的()(溶解細胞膜)，置于()上充分攪拌10分鐘(加速細胞破裂)，細胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放蒸餾水

加()到()體積，再加40％體積的()(溶解細胞膜)，置于()上充分攪拌10分鐘(加速細胞破裂)，細胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放原血液蒸餾水

加()到()體積，再加40％體積的()(溶解細胞膜)，置于()上充分攪拌10分鐘(加速細胞破裂)，細胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放原血液甲苯蒸餾水

加()到()體積，再加40％體積的()(溶解細胞膜)，置于()上充分攪拌10分鐘(加速細胞破裂)，細胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放原血液甲苯磁力攪拌器蒸餾水將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:(3)分離血紅蛋白溶液有機溶劑無色透明的甲苯層脂類物質白色脂溶性物質沉淀層血紅蛋白溶液紅色透明液體紅細胞破碎物沉淀暗紅色沉淀物分離血紅蛋白溶液取()ml的血紅蛋白溶液裝入()中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的()中，pH為()，透析12小時，目的是()或用于更換樣品中的()。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。(4)透析取()ml的血紅蛋白溶液裝入()中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的()中，pH為()，透析12小時，目的是()或用于更換樣品中的()。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。(4)透析1取()ml的血紅蛋白溶液裝入()中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的()中，pH為()，透析12小時，目的是()或用于更換樣品中的()。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。透析袋(4)透析1取()ml的血紅蛋白溶液裝入()中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的()中，pH為()，透析12小時，目的是()或用于更換樣品中的()。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。透析袋磷酸緩沖液(4)透析1取()ml的血紅蛋白溶液裝入()中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的()中，pH為()，透析12小時，目的是()或用于更換樣品中的()。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。透析袋磷酸緩沖液7.0(4)透析1取()ml的血紅蛋白溶液裝入()中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的()中，pH為()，透析12小時，目的是()或用于更換樣品中的()。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。除去樣品中分子量較小的雜質透析袋磷酸緩沖液7.0(4)透析1取()ml的血紅蛋白溶液裝入()中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的()中，pH為()，透析12小時，目的是()或用于更換樣品中的()。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。除去樣品中分子量較小的雜質透析袋磷酸緩沖液7.0緩沖液(4)透析1利用透析袋透析2.凝膠色譜制作1）凝膠色譜柱的制作①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好。

a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；

b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的()，在0.5ml的()頭部切下()長的一段，插入橡皮塞孔內，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好。

a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；

b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的()，在0.5ml的()頭部切下()長的一段，插入橡皮塞孔內，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。凹穴②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好。

a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；

b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的()，在0.5ml的()頭部切下()長的一段，插入橡皮塞孔內，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好。

a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；

b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的()，在0.5ml的()頭部切下()長的一段，插入橡皮塞孔內，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管5cm底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。注意c.剪尼龍網小圓片覆蓋在()上，用()的尼龍紗將橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色譜柱下端用移液頭部做()，連接一細的()，并用螺旋夾控制尼龍管的()，另一端放入收集()的

收集器內。c.剪尼龍網小圓片覆蓋在()上，用()的尼龍紗將橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色譜柱下端用移液頭部做()，連接一細的()，并用螺旋夾控制尼龍管的()，另一端放入收集()的

收集器內。橡皮塞的凹面c.剪尼龍網小圓片覆蓋在()上，用()的尼龍紗將橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色譜柱下端用移液頭部做()，連接一細的()，并用螺旋夾控制尼龍管的()，另一端放入收集()的

收集器內。橡皮塞的凹面100目c.剪尼龍網小圓片覆蓋在()上，用()的尼龍紗將橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色譜柱下端用移液頭部做()，連接一細的()，并用螺旋夾控制尼龍管的()，另一端放入收集()的

收集器內。橡皮塞的凹面100目上部c.剪尼龍網小圓片覆蓋在()上，用()的尼龍紗將橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色譜柱下端用移液頭部做()，連接一細的()，并用螺旋夾控制尼龍管的()，另一端放入收集()的

收集器內。橡皮塞的凹面100目上部出口部位c.剪尼龍網小圓片覆蓋在()上，用()的尼龍紗將橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色譜柱下端用移液頭部做()，連接一細的()，并用螺旋夾控制尼龍管的()，另一端放入收集()的

收集器內。橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龍管c.剪尼龍網小圓片覆蓋在()上，用()的尼龍紗將橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色譜柱下端用移液頭部做()，連接一細的()，并用螺旋夾控制尼龍管的()，另一端放入收集()的

收集器內。橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龍管打開與關閉c.剪尼龍網小圓片覆蓋在()上，用()的尼龍紗將橡皮塞(

)包好，插到玻璃管一端。d.色譜柱下端用移液頭部做()，連接一細的()，并用螺旋夾控制尼龍管的()，另一端放入收集()的

收集器內。橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龍管打開與關閉色譜流出液⑤安裝其他附屬結構。③頂塞的制作：插入安裝了玻璃管的橡皮塞④組裝：

將上述三者按相應位置組裝成一個整體。2）凝膠色譜柱填料的處理(1)凝膠的選擇：

()(G-75)

“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。

75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。2）凝膠色譜柱填料的處理(1)凝膠的選擇：

()(G-75)

“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。

75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。交聯(lián)葡聚糖凝膠（2）方法：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于()中充分溶脹后，配成()。（2）方法：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于()中充分溶脹后，配成()。蒸餾水（2）方法：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于()中充分溶脹后，配成()。蒸餾水凝膠懸浮液①固定：將色譜柱垂直固定在支架上②裝填：將()一次性的緩慢倒入(

)內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。（3）凝膠色譜柱的裝填方法①固定：將色譜柱垂直固定在支架上②裝填：將()一次性的緩慢倒入(

)內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。（3）凝膠色譜柱的裝填方法凝膠懸浮液①固定：將色譜柱垂直固定在支架上②裝填：將()一次性的緩慢倒入(

)內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。（3）凝膠色譜柱的裝填方法凝膠懸浮液色譜柱凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。裝填凝膠柱時不能有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。注意③洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在(

)高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液(pH為7.0)充分()12小時。③洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在(

)高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液(pH為7.0)充分()12小時。50cm③洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在(

)高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液(pH為7.0)充分()12小時。洗滌平衡50cm在提取血紅蛋白實驗中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？思考在提取血紅蛋白實驗中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學研究。思考液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象，否則重新填裝。注意裝配好的凝膠柱你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？思考

如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？思考3）樣品加入與洗脫①加樣前打開下端出口，使柱內凝膠面上的()緩慢下降到與()平齊，關閉出口。50cm高3）樣品加入與洗脫①加樣前打開下端出口，使柱內凝膠面上的()緩慢下降到與()平齊，關閉出口。緩沖液50cm高3）樣品加入與洗脫①加樣前打開下端出口，使柱內凝膠面上的()緩慢下降到與()平齊，關閉出口。緩沖液凝膠面50cm高②加透析樣品①調整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用()將1ml()的樣品加到色譜柱的()③樣品滲入凝膠床：()④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待()接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每()收集一試管連續(xù)收集①調整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用()將1ml()的樣品加到色譜柱的()③樣品滲入凝膠床：()④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待()接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每()收集一試管連續(xù)收集吸管①調整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用()將1ml()的樣品加到色譜柱的()③樣品滲入凝膠床：()④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待()接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每()收集一試管連續(xù)收集吸管透析液①調整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用()將1ml()的樣品加到色譜柱的()③樣品滲入凝膠床：()④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待()接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每()收集一試管連續(xù)收集吸管透析液頂端①調整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用()將1ml()的樣品加到色譜柱的()③樣品滲入凝膠床：()④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待()接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每()收集一試管連續(xù)收集吸管透析液頂端樣品完全進凝膠層①調整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用()將1ml()的樣品加到色譜柱的()③樣品滲入凝膠床：()④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待(