貝類吞噬作用及相關(guān)非我識別作用的研究進展

貝類吞噬作用及相關(guān)非我識別作用的研究進展

這類雜魚在中國的水生養(yǎng)殖中具有重要的經(jīng)濟意義。但近年來頻發(fā)的大規(guī)模病害嚴重阻礙了貝類養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。目前從生理、病理、種質(zhì)、營養(yǎng)、生態(tài)等各方面對防治貝類病害進行了很多研究。其中從貝類免疫學(xué)角度進行的研究,前人尚涉足較少,逐漸成為貝類病害研究的熱點之一。貝類沒有免疫球蛋白以及淋巴系細胞,因此缺乏獲得性免疫(acquiredimmunity或adaptiveimmunity),其免疫防御功能依賴于天然免疫(innateimmunity)的有關(guān)機制。這些免疫防御機制主要由貝類的血細胞來行使。目前關(guān)于貝類血細胞的分類雖然仍沒有一致的看法,但粒細胞(granulocyte)和透明細胞(hyalinocyte)作為兩種主要的細胞類型得到一致的公認。這兩種細胞承擔(dān)了已知主要的免疫防御功能如吞噬、包囊、愈傷、移植排斥等。其中主要由粒細胞行使的吞噬作用是貝類抵御外物入侵的主要防線,在貝類的免疫防御中起重要作用。本文就貝類的吞噬作用及相關(guān)的非我識別作用的研究進展做一綜述。1細胞對食肉的作用吞噬作用的功能主要是清除侵入機體的外源異物如生物大分子、無機物顆粒、細菌、真菌,以及自身的壞死細胞及細胞碎片等。同時也是提供營養(yǎng)的一種手段。在大多數(shù)報道的貝類中,吞噬作用主要由粒細胞完成,透明細胞也具有一定的吞噬能力,但不是主要的。另有報道在結(jié)締組織中有一類固定的細胞也可以進行吞噬作用,如澳大利亞石鱉Liolophuragaimardi,它們在超微結(jié)構(gòu)和組織化學(xué)(不含過氧化物酶)方面均與粒細胞不同,這類細胞可能主要是起消化和營養(yǎng)作用。從免疫防御的角度講,血細胞可以活躍地趨化到炎癥和損傷部位,進行吞噬,是免疫防御的主要細胞類型。1.1內(nèi)吞及細胞的釋放過程吞噬作用的過程大致可以分為趨化、黏附、內(nèi)吞以及殺傷消化四個階段。研究證明貝類血細胞可以向外源顆粒趨化靠近。Schmid1975年通過體外實驗,第一次揭示了貝類血細胞的趨化行為。發(fā)現(xiàn)田螺Viviparusmalleatus的粒細胞可以被經(jīng)80℃滅活的金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus菌以及細菌胞壁物質(zhì)N-乙酰葡糖胺吸引。貝類具有開放式循環(huán)系統(tǒng),器官浸浴在血淋巴中,血管也沒有完整的內(nèi)皮系統(tǒng),血細胞可以較自由地到達廣泛的器官和組織,與外來物質(zhì)的接觸較為充分。因此,趨化的選擇意義不象在高等動物那樣重要。血細胞靠近異物后首先發(fā)生黏附。隨后,血細胞伸出偽足對異物進行包裹,偽足相接觸后細胞質(zhì)膜融合,形成吞噬體(phagosome)進入細胞。Cajaraville和Pal1995年對貽貝Mytilusedulis亞顯微結(jié)構(gòu)的電鏡研究表明,粒細胞和透明細胞都可以由局部細胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成衣被小泡或無衣被的電子透明的內(nèi)吞小體(endosome),完成內(nèi)吞。LeGall等1988年以及Moore等1992年并證明內(nèi)吞過程有細胞骨架的活躍參與。粒細胞完成對異物的吞噬后,通過兩條途徑對其進行處理。一是吞噬體與溶酶體融合,其內(nèi)容物被溶酶體中的水解酶類消化降解。另一條途徑通過伴隨吞噬作用的呼吸爆發(fā)(respiratoryburst)產(chǎn)生大量活性氧自由基,殺傷吞入的微生物。超微結(jié)構(gòu)研究顯示了吞噬體與溶酶體融合的過程。貝類溶酶體中含有豐富的水解酶類,如酸性磷酸酶、蛋白酶、非特異性脂酶、糖苷酶等。吞噬顆粒在溶酶體酶的作用下被水解消化,此時溶酶體中可見到清楚的環(huán)狀片層樣膜結(jié)構(gòu),表明細胞在進行活躍的胞內(nèi)消化。細胞中還可觀察到多胞小體(MVB)的出現(xiàn)。細胞質(zhì)中有大量糖原顆粒聚集體以及脂肪滴出現(xiàn),被認為是細胞內(nèi)消化的產(chǎn)物。這些消化產(chǎn)物隨著血液循環(huán)被血細胞帶到各處組織作為營養(yǎng)物質(zhì)傳遞給其它細胞。如果吞噬了不可消化的物質(zhì),吞噬細胞將通過血細胞滲出(diapedesis),經(jīng)過腎上皮、外套膜、腸、生殖管等遷移到外部環(huán)境而離開機體,這是一種自殺性的行為?；蛘哌w移到身體某一部分,變?yōu)榇x靜默,永久居留。伴隨吞噬作用,貝類的粒細胞還可向血漿中釋放溶酶體酶,即所謂的脫顆粒作用。溶酶體與細胞質(zhì)膜融合并釋放內(nèi)容物的過程得到許多學(xué)者的觀察證實。Cheng在1981年的綜述文章中認為在某些情況下,當(dāng)內(nèi)吞還沒有全部完成,即包繞異物的偽足還沒有完全接觸、融合形成吞噬體時,與溶酶體的融合已經(jīng)發(fā)生,溶酶體內(nèi)容物因此可以逸散到細胞外,也是溶酶體酶釋放的一個途徑。Cajaraville和Pal1995年對貽貝Mytilusedulis進行的超微結(jié)構(gòu)觀察則認為吞噬和脫顆?？赡芊謩e由不同的粒細胞完成,因為在富含吞噬殘余小體(phagocytosedresidualbody)的粒細胞中,仍然充滿了顆粒,沒有發(fā)現(xiàn)脫顆粒,而在進行胞吐的粒細胞則沒有發(fā)現(xiàn)吞噬的跡象。另一條對吞入物進行處理的途徑是通過伴隨吞噬作用的呼吸暴發(fā)產(chǎn)生多種活性氧自由基,較近的文獻一般稱之為反應(yīng)性氧媒介(reactiveoxygenintermediatespeciesROIs),這些ROIs可以利用其強氧化性直接殺傷吞入的微生物。據(jù)Trush等1978年報道,ROIs的產(chǎn)生與位于細胞質(zhì)膜上的NADPH-氧化酶(NADPH-oxidase)有關(guān)。在呼吸爆發(fā)過程中產(chǎn)生的ROIs包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基、超鹵化物(hypohalides)等。它們對磷脂雙分子膜、蛋白質(zhì)乃至核酸都會造成嚴重的損傷。目前,檢測過的絕大多數(shù)雙殼或腹足貝類中都發(fā)現(xiàn)了伴隨吞噬的呼吸爆發(fā)現(xiàn)象。但并不是所有的貝類都有此種殺傷機制,如Lopez等用細胞化學(xué)方法在蛤仔Ruditapesdecussates沒有檢出NADPH氧化酶,而對照貽貝Mytilusgalloprovincialis則呈陽性。Cheng早在1976年研究了硬殼蛤Mercenariamercenaria吞噬過程的能量需求,發(fā)現(xiàn)其沒有伴隨吞噬作用的耗氧增加,也沒有基于髓過氧化物酶的過氧化物殺傷機制。1.2癟殼發(fā)生學(xué)中包囊的結(jié)構(gòu)如果異物比血細胞大得多,例如寄生蟲、壞死組織、外源植入物等,則血細胞對該異物的吞噬動員了全部的細胞膜表面積,表現(xiàn)為血細胞在異物表面上完全伸展,扁平化,由若干吞噬細胞共同將外物包裹起來。這稱為包囊作用。Bayne稱之為受挫的吞噬作用。最初,血細胞對異物的包裹比較疏松,隨著越來越多的細胞聚集到異物處,與異物直接接觸的細胞變扁平,并充分伸展,形成包裹異物的連續(xù)的細胞層。在伸展和扁平化的過程中微管以及成束的微絲出現(xiàn)在細胞質(zhì)周邊區(qū)域。說明這些結(jié)構(gòu)在細胞伸長的過程中起到了重要的作用。最后,包囊變得越來越堅固。血細胞通過細胞內(nèi)和細胞外消化將被包囊的異物清除。2血紅蛋白異質(zhì)的檢測在吞噬作用中涉及到的一個重要的問題是,血細胞怎樣有效地識別異物,區(qū)分自我和非我(selfandnon-self)。這是吞噬作用發(fā)揮防御功能的前提。2.1小鼠骨髓細胞因子檢測由于貝類沒有類似于高等動物主要組織相容性復(fù)合體(MHC),免疫球蛋白(Ig)那樣的基于可重排分子的識別系統(tǒng)。貝類對異物的識別主要依賴于一些其他非特異的識別因子。研究發(fā)現(xiàn),貝類血細胞的趨化、黏附和吞噬過程都可被某些血清因子促進。這說明貝類血細胞對異物的識別,類似于高等生物,也依賴于血漿中某些因子的作用。這些因子統(tǒng)稱為調(diào)理素(opsonin)。在環(huán)節(jié)動物、昆蟲、甲殼動物、棘皮動物以及貝類中均已證明有體液調(diào)理因子存在。Sminia等1979年證明將酵母和羊紅細胞預(yù)先在靜水椎實螺Lymnaeastagnalis的無細胞血淋巴中進行溫育,可以顯著提高其血細胞在體外對酵母和羊紅細胞的吞噬。Renwrantz和Mohr1978年的體內(nèi)實驗從另一個角度說明了同樣的問題。他們將人A1和B型紅細胞預(yù)先與蓋罩大蝸牛Helixpomatia的血清在體外進行溫育處理,然后注射入該動物,發(fā)現(xiàn)可以顯著提高其對人紅細胞的清除速率。他們還發(fā)現(xiàn),如果在首次注射大劑量未經(jīng)處理的A1型人紅細胞后,經(jīng)過12~19h后再次注射同樣未經(jīng)處理的A1型人紅細胞時,則清除速度與第一次注射相比極為緩慢,表現(xiàn)出一種抑制效應(yīng)。而如果將第二次注射的紅細胞預(yù)先與該種動物的血清進行溫育,則其清除速度與第一次注射類似。這說明產(chǎn)生抑制效應(yīng)的原因是第一次注入的大劑量的外源顆粒消耗掉了血漿中某種對識別起輔助作用的調(diào)理因子而不是飽和了動物的吞噬能力。說明調(diào)理素對血細胞識別異物有重要的促進作用。但并不是所有的識別作用都依賴于血漿因子的調(diào)理作用,如Renwrantz等1981年證明蓋罩大蝸牛H.pomatia對酵母菌的清除并不依賴于血漿成分的調(diào)理作用。在高等動物中起調(diào)理作用的主要是免疫球蛋白,補體成分以及細胞或細菌表面的凝集素(agglutininorlectin)分子。在貝類中還沒有存在類抗體樣分子和補體系統(tǒng)的可靠證據(jù),但血淋巴中的內(nèi)源性凝集素已被證明對于識別和吞噬外源顆粒具有重要的輔助作用。凝集素是一類糖蛋白,可以與外源異物相結(jié)合,同時可以與吞噬細胞相結(jié)合,象橋梁一樣連接血細胞和異物,起到調(diào)理作用。另外,Cheng和Dougherty1989年認為吞噬細胞的脫顆粒作用釋放出的酶可以修飾外來細胞的表面結(jié)構(gòu),從而使外源細胞被有效識別。因此溶酶體酶在此也起到了調(diào)理素的作用。2.2膜表面受體的檢測無論識別是否依賴調(diào)理作用,吞噬細胞表面特定的識別分子(受體)都是必需的。在需要調(diào)理素的情況下,調(diào)理素通過識別并結(jié)合于外來物質(zhì)或損傷組織的表面,為吞噬細胞表面受體提供了易于識別的標(biāo)記,受體識別外來顆粒表面的調(diào)理素分子。而在不依賴調(diào)理素的情況下,細胞表面受體直接識別異物。識別的完成最終取決于吞噬細胞膜上的受體。目前對貝類吞噬細胞的膜表面特征還知之甚少。一些工作揭示了吞噬細胞表面存在不同專一性受體。如Fryer等1989年發(fā)現(xiàn)雙肺螺Biomphlariaglabratad血細胞對未被調(diào)理的酵母的識別可被beta-1,3葡聚糖(glucan)封閉,因而推測雙肺螺B.glabratad血細胞具有beta-1,3葡聚糖專一性的表面受體。由于凝集素具有與血細胞結(jié)合的特性,目前已被越來越多地用于對貝類血細胞的表面分子特征進行研究。單克隆抗體以及多克隆抗體也被用來對貝類血細胞表面特征進行研究,但主要集中在對血細胞的分型。雖然目前這方面的工作還不多,但單克隆抗體和凝集素的運用必將大大推動對細胞膜表面結(jié)構(gòu)的了解,并將成為重要的研究手段。2.3關(guān)分子模式pamp貝類沒有象高等動物那樣復(fù)雜的基于基因重排分子的識別系統(tǒng),它怎樣識別眾多入侵的病原體和異物呢?近年來研究發(fā)現(xiàn),天然免疫識別分子可以識別為一大組或幾大組病原體所共有的,保守的,不同于宿主自身成分的某類分子的結(jié)構(gòu)模式(稱為病原體相關(guān)分子模式,pathogen-associatedmolecularpattern,PAMP),如細菌細胞壁中的肽聚糖,革藍氏陰性菌細胞壁的脂多糖,革藍氏陽性菌細胞壁的磷壁酸,細菌DNA中未甲基化的CpG二核苷酸,RNA病毒的雙鏈RNA等。與抗體對抗原物質(zhì)的識別不同的是,天然免疫分子識別的不是高度專一性的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)(抗原決定簇),而是某種結(jié)構(gòu)模式,因而是廣譜的。這些對PAMP進行識別的免疫識別分子包括血漿中的調(diào)理因子以及血細胞表面的某些受體,它們的存在保證了貝類可以有效地對異物進行識別進而清除。對外源無機物顆