蛋白質組學與中醫(yī)證候研究的互融性

蛋白質組學與中醫(yī)證候研究的互融性

蛋白質組學是繼基因和基因組學之后最受關注的生物研究領域之一。自1994年澳大利亞科學家威廉姆斯和韋格勒提出了相關概念以來，僅花了10多年的時間，而中國的正式研究只有幾年時間。然而，蛋白質組的研究非常迅速。由于蛋白質組在疾病發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療中所具有的重要性,且它的很多特性與中醫(yī)“證”的特征十分吻合,因此將蛋白質組引入中醫(yī)證實質的研究具有特別重要的意義。中醫(yī)證候的實質研究中醫(yī)與西醫(yī)的重大區(qū)別之一是解釋疾病發(fā)生原因的著眼點不同,西醫(yī)基于“實體中心論”,即注重物質基礎,而中醫(yī)則基于“關系中心論”,關注功能與相互關系。作為中醫(yī)臨床用藥最主要的理論根據,或者說中醫(yī)臨床診治疾病最重要的方法是辨證論治,它是中醫(yī)特有的概念,是聯系中醫(yī)基礎理論與臨床的橋梁?！白C”是對疾病所處一定階段的病因、病性與病位等所作的概括。由于中醫(yī)對疾病的注重從整體和宏觀的角度認識事物,善于采用比類取象、司外揣內等思維方法來觀察和研究人體的生理功能和病理變化,辨證的過程實際上是通過疾病外在表象的收集進行綜合分析,從而推測演繹出疾病的病因、病性、病位、病勢等要素進而歸納出“證”的過程,它是一種“功能態(tài)”,是機體內因外因相互作用的結果,并可能隨著疾病的發(fā)展而發(fā)生變化,因此中醫(yī)的證候具有整體性、動態(tài)性、時相性、復雜性等特點,除出現“同病異證”外,“異病同證”的現象也十分常見。由于“證”無論在中醫(yī)基礎理論還是中醫(yī)臨床中都具有十分重要的地位,近幾十年來對“證”實質的研究進行了十分有益的探索。證候實質的研究主要從證的臟腑、陰陽、虛實、病邪性質等角度展開,例如陰虛證和陽虛證、脾氣虛證和脾陽虛證、痰濁證和血瘀證等。涉及的化學物質主要有激素、酶類、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、三磷酸腺苷(AMP)、神經遞質、微量元素等。研究證候的方法多種多樣,如主癥辨證法、主次癥判斷法、微觀辨證法、混沌學方法、分析綜合法、功能定量法、多學科多層次多因素分析法等,但其發(fā)展方向歸納起來主要有2個:一是整體研究法,或稱宏觀綜合法,即在傳統(tǒng)繼承為主的基礎上進行創(chuàng)新,在不破壞中醫(yī)傳統(tǒng)理論的前提下,以整體觀和辨證論為基礎,在整體的層次上從宏觀的角度進行研究,這類研究注重的是功能模擬和各系統(tǒng)之間的聯系,較多地采用臨床流行病學和數學的方法,系統(tǒng)地探討中醫(yī)證候的演變規(guī)律、證名和證候內涵的規(guī)范化、證的分級量化等。一是微觀分析法,即采用現代醫(yī)學還原研究為主的方法,用實驗檢測指標闡釋證候機理或對證候做出定量診斷,此類研究注重的是實體結構和微觀指標。由于兩類方法在認識方法、研究手段、觀察角度等方面各不同,研究的結論必然有異,其優(yōu)劣長短亦各不相同。事實上,微觀組成整體,整體包含微觀,了解微觀才能對證的物質基礎進行深層次研究,研究整體方能對系統(tǒng)的功能和系統(tǒng)之間的聯系全面了解?！白C”作為一種功能表現或一種有規(guī)律的病理表現,必然有其物質結構來支配它,中醫(yī)“有諸內,必形諸外”也從另一角度說明了內在物質結構是外在功能表現的基礎。在對證實質的研究中,由于多數實驗指標缺乏特異性,因此很難用單一指標來作定性、定量、定位的說明,也難以反映中醫(yī)證候的整體性和復雜性。近些年開始從基因和蛋白質組學角度研究“證”實質,尤其是將蛋白質組學引入中醫(yī)證實質研究受到普遍重視。蛋白質組學研究內容蛋白質組(proteome)是指一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質,是對應于一個基因組的所有蛋白質構成的整體,由于在人體組織的不同發(fā)育階段、不同生理條件或不同的環(huán)境影響下,其蛋白質的存在狀態(tài)各不相同,因此蛋白質組是一個在時空和時間上動態(tài)變化著的整體。蛋白質既是生物體最重要的結構,又是生命活動的直接執(zhí)行者,它的組成遠比基因龐大和復雜,具有相對獨立的代謝過程,對生物機體內部和外部因素具有產生反應的能力,而且蛋白質之間存在著活躍、廣泛的相互作用,因此蛋白質組是基因組研究的邏輯發(fā)展。與具有同源性和普遍性的基因相比,蛋白質組具有動態(tài)性、時間性、空間性、特異性等特征。蛋白質組學(proteomics)則是指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興學科,其目的是從整體的角度分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成成分、表達水平和修飾狀態(tài),了解蛋白質之間的相互作用與聯系,揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律。其現階段主要研究內容是了解某種特定的細胞、組織或器官的蛋白質種類,確定其數量,分析并描繪其三維結構;了解各蛋白質的功能和相互作用。目前主要研究手段有雙向凝膠電泳技術(2-DE)、生物質譜技術(bio-massspectrometry)、蛋白質芯片(proteinchip)和生物信息學(bioinformatics)技術等。蛋白質組學的特點是采取高分辨率蛋白質分離手段,結合高效率的鑒定技術,全景式的展示各種特定情況下的蛋白質譜,組織細胞在一定階段或某一狀態(tài)下相關的蛋白質譜時、空、量效方面的變化,其最大的特色在于建立了以整體觀來剖析生命現象的理念。蛋白質組的整體性、動態(tài)性、時空性、復雜性與同樣具有整體性、動態(tài)性、時相性、復雜性等特點的中醫(yī)“證”有著驚人的相似,其中可能存在某種內在聯系和對應關系。因此,與“證”實質研究中一般的微觀指標相比,蛋白質組學有著特殊的優(yōu)勢,也更加符合證自身的特點。提出最佳模型的檢測除進行證候蛋白質組相關性的理論探討之外,目前已有眾多的實驗研究報道,主要就蛋白質組在中醫(yī)證型研究中的技術條件、思路方法以及具體證型與蛋白質組的相關性展開研究。黃黎明等在分析了蛋白質組學與證候的內在聯系的同時,對證型特點、造模方法、蛋白質組學特點進行分析,提出采用雙向電泳(2-DE)+質譜(MS)+數據庫的蛋白質組解決方案及藥理學實驗方法,是探求腎陽虛證的蛋白質學本質較好的方法。鐘小蘭等在常規(guī)蛋白質組2-DE分離技術的基礎上對血清樣品處理、膠條選擇、上樣量和聚焦參數等加以優(yōu)化從而摸索新的方法。結果建立了穩(wěn)定的血清蛋白質組2-DE分離技術,運用于肝郁證相關蛋白組研究,在大鼠血清中獲取了12個差異蛋白,在人血清中亦初步篩選出12個差異蛋白點,其方法具有穩(wěn)定性、可重復性。譚秦湘等通過檢索Medline和中國期刊網1995-01至2005-12關于血清蛋白組學技術應用及證候蛋白質組理論探討的相關文獻,發(fā)現應用蛋白質組學的研究方法,可以研究不同疾病肝郁證中血清蛋白質的變化規(guī)律及特異蛋白質的表達規(guī)律,就有可能在復雜的多種致病因素下找到證候的本質并建立肝郁證候的微觀辨證指標體系。吳紅金等采集正常健康者、冠心病心血瘀阻證病人的血漿,用蛋白質組學技術測定冠心病血瘀證與正常人血漿中的蛋白變化,結果發(fā)現冠心病血瘀證病人血漿與正常相比有3個蛋白質下調和6個蛋白質上調,膠內酶切提取蛋白進行質譜鑒定,其中冠心病血瘀證病人血漿與正常相比升高的蛋白質有免疫球蛋白、纖維蛋白原、粒酶,冠心病血瘀證病人血漿與正常相比降低的蛋白質有細胞表面糖蛋白(CD44SP)。因而認為纖維蛋白原、粒酶有望作為診斷冠心病血瘀證的標志物。鐘小蘭等以束縛制動法制備肝郁證大鼠模型,運用蛋白質組技術鑒定差異表達蛋白質,結果發(fā)現9個具有明顯表達差異的蛋白質斑點,經鑒定可以確定的6個蛋白質,分別為轉甲狀腺素蛋白(transthyretin,TTR)、水解酶Bal-647、血清白蛋白前體、抗乙酰膽堿受體抗體Fab片段、Igλ-2鏈C區(qū)和β1球蛋白。其篩選出的差異表達蛋白質主要涉及免疫、神經內分泌和營養(yǎng)物質代謝方面,和現有研究結果相符,證實從蛋白質組學的角度研究證實質是可行的。劉麗麗等在四物湯對環(huán)磷酰胺致血虛證小鼠骨髓蛋白質組影響的研究中發(fā)現,環(huán)磷酰胺使小鼠骨髓中l(wèi)2個蛋白表達上調、3個蛋白達下調,四物湯可使CTX造模后這些表達改變的蛋白有不同程度恢復。認為四物湯可能通過影響與細胞凋亡、血干祖細胞增殖分化有關的蛋白質而促進骨髓造血。謝文光等在研究赤芍藥對大鼠熱毒血瘀證的血清蛋白質組變化的影響中發(fā)現,用脂多糖(LPS)造模所致熱毒血瘀證大鼠的血清在2-DE膠上13個蛋白點(xPr)出現非常明顯的含量變化,與正常組比較,LPS組的xPrl6、xPrl9的點容量值均顯著降低,xPrl、xPr2、xPr3、xPr4、xPr6、xPr7、xPr8、xPr9、xPrl1、xPrl2、xPr23的點容量值均顯著增高。盧德趙等應用凝膠內差異顯示電泳技術研究腎陽虛大鼠肝線粒體蛋白質組,8個分別來自于腎陽虛大鼠和正常大鼠的肝線粒體蛋白質樣品(各4個)分別用熒光染料Cy3、Cy5標記,以及8個樣品等量混合物用Cy2標記作為內標,每一Cy3、Cy5標記樣品與Cy2標記的內標等量混合后在同一膠中進行電泳分離,經不同光激發(fā)后掃描得到不同樣品的蛋白質組圖譜。經DeCyder軟件結合內標分析,獲得16個差異蛋白質,經質譜測定和與蛋白質文庫比對,鑒定出11個蛋白質。其中,腎陽虛動物熱休克蛋白60和70、肌氨酸脫氫酶、氨甲酰磷酸合成酶、亞硫酸鹽氧化酶、ATP合酶、醛脫氫酶和NADH脫氫酶表達量增加,而丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、脂酰輔酶A脫氫酶和鳥氨酸氨基轉移酶表達量降低。實驗表明,腎陽虛動物能量代謝相關酶的變化與腎陽虛的臨床虛寒癥狀有關。綜上所述,由于蛋白質組的很多特征如整體性、動態(tài)性、時空性、復雜性等與中醫(yī)“證”的特點十分吻合,而且具有特異性,以蛋白質組學為切入點進行“證”實質研究在現代實驗研究中具有明顯的優(yōu)勢,目