青年齡奶山羊下丘腦催產(chǎn)素的超敏免疫組化研究

青年齡奶山羊下丘腦催產(chǎn)素的超敏免疫組化研究

腦癱是人類和動物神經(jīng)分泌物的中心和內(nèi)臟機的重要控制區(qū)。例如，促進生產(chǎn)（oxytolin）是對腦癱中最重要發(fā)現(xiàn)和澄清的神經(jīng)遺產(chǎn)，其結(jié)構(gòu)由九個氨基酸組成。它們不僅在調(diào)節(jié)生殖活動方面發(fā)揮著重要作用。OT對心血管功能、消化功能、體液滲透壓、神經(jīng)免疫和體溫等也有調(diào)節(jié)作用,并與應(yīng)激反應(yīng)、學(xué)習(xí)記憶、睡眠與覺醒、痛覺調(diào)制、動物的行為活動等有密切關(guān)系。生理功能的產(chǎn)生必定有其形態(tài)學(xué)基礎(chǔ),OT合成部位的研究成為該領(lǐng)域的熱點。對倉鼠、大鼠、豬、人、奶山羊和樹鼠句的OT合成部位的定位研究結(jié)果表明,合成OT的部位已由傳統(tǒng)概念的室旁核(PVN)和視上核(SON)擴大到下丘腦的廣泛區(qū)域。上述研究均是研究了某種動物某一生理階段的OT分布,尚未見到對OT在不同生殖周期奶山羊下丘腦分布的系統(tǒng)研究,而不同生理時期OT分布有較大的變化。為此,筆者于2004年2～6月在西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)實驗室,用特異性強、靈敏度高的免疫組化鏈霉素抗生物蛋白一過氧化物酶(Streptaridin-peroxidase,SP)法,對8～10月齡的奶山羊下丘腦中OT的神經(jīng)元的分布進行研究,旨在為進一步總結(jié)不同生理期下丘腦OT的分布特點、生理功能及生殖調(diào)控機理提供系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方面資料。1材料和方法1.1羊腦組織病理學(xué)觀察8～10月齡健康奶山羊8只,臨床健康,體重25～35kg。山羊頸動脈放血致死,向兩側(cè)頸總動脈同時注入37℃生理鹽水800ml沖去殘血。隨后灌注4℃的含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)1000ml。開顱取腦,切取下丘腦,浸入上述固定液中后固定12h。之后浸入4℃的20%蔗糖PB液,組織塊沉底后即可切片。用冰凍切片機對下丘腦做連續(xù)切片,厚度35μm。每只羊下丘腦制得兩套切片,一套做Nissl染色以確認下丘腦核團位置,部分用作陰性對照實驗;一套進行免疫組化SP法染色。1.2鼠抗ot抗體法免疫組化SP法染色:抗鼠SP超敏試劑盒,福州邁新公司進口分裝;鼠抗OT抗體,第四軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所提供;葡萄糖氧化酶,美國SIGMA公司生產(chǎn)。將切片經(jīng)0.01mol/L的PBS緩沖液沖洗3次,每次10min,然后按以下步驟進行反應(yīng),各步驟間均用0.01mol/L的PBS緩沖液充分漂洗(洗3次,每次10min)(1)切片入A液(過氧化物酶阻斷劑),室溫下孵育1h。(2)入B液(非免疫血清),室溫下孵育40min。(3)入鼠抗OT抗體(稀釋倍數(shù)為1:10000),4℃下孵育48～72h。(4)入C液(生物素標記的二抗),37℃下孵育1.5h。(5)入D液(鏈霉素抗生物素蛋白一過氧化物酶),37℃下孵育1.5h。(6)經(jīng)葡萄糖氧化酶—DAB—硫酸鎳胺方法呈色,室溫下呈色15～20min。然后按常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照染色:用0.01mol/L的PBS緩沖液代替鼠抗OT抗體孵育切片,其余步驟同上,進行對照實驗,確定該方法的特異性。Nissl染色:貼片→烘干→甲苯胺藍染色→95%酒精分色→梯度酒精脫水→二甲苯透明→中性樹膠封片→光鏡觀察。切片染色可顯示出下丘腦中各個核團的細胞,參考王剛牛碩士論文《奶山羊下丘腦核團形態(tài)學(xué)及細胞構(gòu)筑學(xué)研究》以及鼠的下丘腦核團定位圖譜,對奶山羊下丘腦各核團進行定位。1.3陽性細胞大小測量免疫組化染色結(jié)果每組切片中相同核團隨機選取5個不同部位,Motic數(shù)碼顯微鏡拍照,用江蘇捷達801形態(tài)分析軟件對陽性細胞進行分析,測量陽性細胞的大小,灰度值,數(shù)目,用均數(shù)±標準差()表示。2室旁核和陽性細胞免疫組化SP法結(jié)合硫酸鎳胺加強的藍色反應(yīng),在光鏡下OT免疫陽性產(chǎn)物呈深藍色,主要呈顆粒狀、均質(zhì)狀分布于細胞質(zhì)中;在細胞外則呈顆粒狀和小點狀。免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元主要分布在室旁核(見圖1)和視上核(見圖2),在交叉上核(見圖3)、視上彌散核(圖4)、穹窿周核、腹內(nèi)側(cè)核、腹外側(cè)核和乳頭體上核較多,有少量分布在弓狀核、室周核、背內(nèi)側(cè)核、環(huán)核、前連核、下丘腦前核、下丘腦外側(cè)區(qū)、乳頭體上核、乳頭體內(nèi)側(cè)核(見表1)。陽性細胞的形態(tài)有圓形、卵圓形、多角形;有的陽性細胞突起明顯。根據(jù)細胞中陽性物質(zhì)的多少和核團中陽性細胞數(shù)量,可分為強陽性、中等陽性、弱陽性核團。以神經(jīng)元胞質(zhì)和突起均出現(xiàn)陽性產(chǎn)物的為強陽性細胞;僅在胞質(zhì)存在而且含量很少,突起很不明顯的為弱陽性細胞;中等陽性細胞介于二者之間。3ot在奶山羊不同繁殖時期的分布隨著神經(jīng)生物學(xué)新技術(shù)的每一次問世,人們對下丘腦中OT分布的研究就不斷取得突破性成果,并將OT的定位與功能結(jié)合了起來,如視前內(nèi)側(cè)區(qū)、下丘腦前區(qū)及腹內(nèi)側(cè)區(qū)的OT調(diào)節(jié)著倉鼠的性感受,母羊分娩后撫育幼羊的母性行為與下丘腦分泌到腦脊液中的OT濃度升高有關(guān)。在分娩前血漿中OT含量大增,以便在分娩時釋放,以與子宮肌內(nèi)大量的OT受體(OTR)結(jié)合而促進子宮平滑肌收縮,利于胎兒娩出。分娩后子宮內(nèi)的OTR濃度迅速降低,而乳腺內(nèi)的OTR濃度卻明顯增加。許多應(yīng)激刺激會引起血漿及腦內(nèi)OT含量發(fā)生變化,但應(yīng)激引起OT釋放的神經(jīng)途徑還不清楚。對OT合成部位的定位研究結(jié)果表明,合成OT的部位已由傳統(tǒng)概念的室旁核(PVN)和視上核(SON)擴大到下丘腦的廣泛區(qū)域如穹窿周核、室周核、下丘腦外側(cè)區(qū)、下丘腦前核、弓狀核、前連合核、交叉上核、乳頭體內(nèi)側(cè)核、腹內(nèi)側(cè)核等,沈霞芬等用ABC法研究表明,在發(fā)情間期成年奶山羊有16個核團存在OT免疫反應(yīng)細胞。卿素珠對繁殖季節(jié)的奶山羊的研究結(jié)果與此類似。本論文實驗用免疫組化超敏SP法對8～10月齡奶山羊的研究結(jié)果表明,OT免疫反應(yīng)細胞在奶山羊下丘腦的19個核團分布,除上述已證明的核區(qū)外,還在視上彌散核(SD)、終紋床核(BNST)、視前交叉核(POSC)有較多分布。這一結(jié)果差異可能與方法的靈敏性及動物的生理期不同有關(guān),并提示,同一動物在不同的生理期下丘腦內(nèi)不同的核團對OT的分泌表達可能不同。筆者在實驗的同期對6～8月齡奶山羊在下丘腦的促性腺激素釋放激素神經(jīng)元(GnRH)分布的研究發(fā)現(xiàn),GnRH主要分布在弓狀核、視上核、穹隆周核、下丘腦外側(cè)區(qū)、腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、乳頭體核團、室旁核、交叉上核和視上彌散核等核(下轉(zhuǎn)第36頁)(上接第7頁)團,而這些核團又和本實驗OT免疫反