基因工程4-1 基因工程的載體

第四章基因克隆載體

1.定義：攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具稱為載體（Vector）。載體的本質(zhì)是DNA。

2.在基因工程中所用的載體，主要有5類：質(zhì)粒（Plasmid）噬菌體

（

phage）的衍生物柯斯質(zhì)粒（Cosmid）單鏈DNA噬菌體M13

動(dòng)物病毒3.理想的載體應(yīng)具備的條件：具有自我復(fù)制能力有適宜的限制酶切位點(diǎn)，最好是對多種常用的限制酶有單一切點(diǎn)，并且這些單一切點(diǎn)在易于被檢測的表型基因上具有一個(gè)或幾個(gè)選擇性遺傳標(biāo)記分子量較小，在受體細(xì)胞內(nèi)有較多的拷貝數(shù)可攜帶足夠長度的外源DNA片斷，并能有效的轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中容易從宿主細(xì)胞中分離純化4.1質(zhì)粒載體4.1.1質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1.質(zhì)粒：是染色體以外能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。它廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中，在霉菌、藍(lán)藻、酵母和不少動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒存在。在基因工程中，多使用大腸桿菌質(zhì)粒為載體。質(zhì)粒分子的大小為1~200kb，它可以“友好”地“借居”在宿主細(xì)胞中，依靠宿主細(xì)胞的現(xiàn)有體系進(jìn)行自身復(fù)制，并將其編碼的一些非染色體控制的遺傳性狀進(jìn)行表達(dá)；同時(shí)質(zhì)粒也提供給宿主細(xì)胞一些抗性、免疫性。2.質(zhì)粒的類型(1)F質(zhì)粒：又叫F因子或性質(zhì)粒（sexplasmid），F(xiàn)+、F-F+

F-，染色體標(biāo)記低頻轉(zhuǎn)移，F(xiàn)因子高頻轉(zhuǎn)移F質(zhì)粒可以整合到染色體上，同步復(fù)制（這種菌株在與F-菌株雜交時(shí)，比F+所產(chǎn)生的遺傳重組頻率要高103倍），稱為Hfr菌株（高頻菌株）。Hfr

F-，染色體標(biāo)記高頻轉(zhuǎn)移，F(xiàn)因子低頻轉(zhuǎn)移F因子從染色體脫離下來時(shí)，往往會(huì)帶有染色體片斷，這種帶有染色體片段的F因子稱為F’因子。(2)R質(zhì)粒：也稱抗藥性因子。R質(zhì)粒編碼一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，此中抗性通常能轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。(3)Col質(zhì)粒：此類質(zhì)粒編碼有控制大腸桿菌素合成的基因，即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。3.質(zhì)粒的分類根據(jù)質(zhì)粒能否自己轉(zhuǎn)移，可分為：接合型質(zhì)粒：自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，除含有自我復(fù)制基因外，還帶有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移的基因。非接合型質(zhì)粒：不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，此類質(zhì)粒能夠自我復(fù)制，但不含轉(zhuǎn)移基因組。從基因工程的安全角度講，非接合型質(zhì)粒用作克隆載體更為合適。根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，可分為：嚴(yán)緊型質(zhì)粒：拷貝數(shù)1~3份松弛型質(zhì)粒：拷貝數(shù)10~60份質(zhì)粒的復(fù)制型不是絕對的，不僅受自身的制約，還同宿主的狀況有關(guān)。

分子量大分子量小接合型質(zhì)?？截悢?shù)少非接合型質(zhì)粒拷貝數(shù)多嚴(yán)緊型復(fù)制松弛型復(fù)制

4.質(zhì)粒的不親和性兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不親和性，也稱不相容性。彼此不相容的質(zhì)粒屬于同一個(gè)不親合群；而彼此能夠共存的親和質(zhì)粒，則屬于不同的不親和群。

不親和群：來源于同一種原始質(zhì)粒，利用相同復(fù)制系統(tǒng)的這類質(zhì)粒。4.1.2幾種常見的質(zhì)粒1.ColEI質(zhì)粒載體屬于大腸桿菌Col類質(zhì)粒中的一種，是一種天然質(zhì)粒。大小為6.3kb，含有EcoRI的單一酶切位點(diǎn)，具有松弛型復(fù)制子。在培養(yǎng)基中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，宿主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長也隨之停止；而質(zhì)粒DNA仍可繼續(xù)進(jìn)行數(shù)小時(shí)的復(fù)制，這樣每個(gè)宿主細(xì)胞所累積的ColEI質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)1000~3000個(gè)。ColEI質(zhì)粒除了具有可以編碼大腸桿菌素EI的基因外，還可以編碼使宿主細(xì)胞對大腸桿菌素EI產(chǎn)生免疫性的基因。對大腸桿菌素的免疫特征可作為一種選擇標(biāo)記。若在ColEI質(zhì)粒的EcoRI位點(diǎn)插入外源DNA序列，則宿主細(xì)胞不能合成大腸桿菌素EI（ColEI-），而具有EI免疫性（ImmEI+）表型的為含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞。ColEI質(zhì)粒的松弛型復(fù)制子幾乎是所有人工質(zhì)粒的組成單元。2.pBR322質(zhì)粒載體是人工構(gòu)建的一種較為理想的大腸桿菌質(zhì)粒載體。大小為4.3kb，分子量為4.2

106dal。具有ColEI松弛型復(fù)制子，拷貝數(shù)為60個(gè)/細(xì)胞。pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)選擇性標(biāo)記：

氨芐青霉素抗性基因（AmpR）：其上有PstI的切割位點(diǎn)

四環(huán)素（Tetracyclin)抗性基因（TetR）：其上有BamHI、HindIII、SalI的切割位點(diǎn)

對pBR322質(zhì)?？衫貌迦胧Щ罘ㄟM(jìn)行重組體的選擇。例如用BamHI切割后插入外源DNA片段，形成AmpR、TetS，在如下的抗菌素培養(yǎng)平板上進(jìn)行檢驗(yàn)，即可方便的篩選出重組體DNA（紅色標(biāo)記的菌落）。pBR322質(zhì)粒共有4363個(gè)核苷酸，規(guī)定核苷酸的計(jì)數(shù)由EcoRI的靶序列開始，以GAATTC中的第一個(gè)T記為核苷酸1，按順時(shí)針方向計(jì)數(shù)。

3.pBR325質(zhì)粒載體由于在質(zhì)粒pBR322中，基因工程最常用的限制酶EcoRI位點(diǎn)不具有插入失活效應(yīng)，因而對其進(jìn)行改進(jìn)得到了質(zhì)粒pBR325，大小為5.4kb。pBR325質(zhì)粒上有三個(gè)選擇性標(biāo)記：

氨芐青霉素抗性基